TLR5-Agonisten verstärken Anti

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 31 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Primäre und adaptive Resistenzen gegen Immun-Checkpoint-Therapien (ICT) stellen ein erhebliches Hindernis für das Erreichen eines verbesserten Gesamtüberlebens dar. Angeborene Immunaktivatoren wurden wegen ihres Antitumorpotenzials aktiv untersucht. Hier berichten wir, dass ein syngenes 4T1-Mammakarzinom-Mausmodell für etablierten hochrefraktären dreifach negativen Brustkrebs ein verbessertes Überleben zeigte, wenn es intratumoral entweder mit dem TLR5-Agonisten Flagellin oder CBLB502, einem Flagellin-Derivat, in Kombination mit Antikörpern gegen CTLA-4 und behandelt wurde PD-1. Langzeitüberlebende Mäuse zeigten bei erneuter Tumorexposition ein immunologisches Gedächtnis und ein ausgeprägtes immunaktivierendes Zytokinprofil, das sowohl die angeborene als auch die adaptive Immunität aktivierte. Niedrige Serumspiegel von G-CSF und CXCL5 (sowie ein hoher IL-15-Wert) waren mögliche prädiktive Biomarker, die mit einem verbesserten Überleben korrelierten. CBLB502-induzierte Verstärkung der ICT wurde auch bei schlecht immunogenen B16-F10-Melanomtumoren beobachtet. Die kombinierte Immun-Checkpoint-Therapie plus TLR5-Agonisten könnte eine neue Therapiestrategie zur Behandlung ICT-refraktärer solider Tumoren bieten.

Immun-Checkpoint-Therapien (IKT) haben neue Therapiemöglichkeiten gegen Krebs mit nachhaltiger Heilwirkung eröffnet1,2. Zwei gut charakterisierte Immun-Checkpoint-Regulatoren, auf die die IKT abzielt, sind PD-1 und CTLA-43,4. PD-1 moduliert die Immunaktivität, indem es die Apoptose immunsuppressiver T-Regs hemmt und die Apoptose antigenspezifischer T-Zellen fördert5. Es ist auch bekannt, dass PD-1 die Aktivierung von B-Zellen hemmt6. Im Gegensatz dazu wird angenommen, dass CTLA-4 die T-Zell-Aktivierung stört4,5. Die Mehrheit der Krebspatienten spricht jedoch nicht auf diese Behandlungen an oder erleidet nach einer gewissen Ansprechphase einen Rückfall7. Ein gemeinsames Thema bei den Resistenzmechanismen ist das Versagen, eine dauerhafte adaptive Reaktion hervorzurufen, da es in einem von mehreren Schritten des Prozesses der Tumorantigenpräsentation Mängel gibt. Es wird angenommen, dass diese Mängel wahrscheinlich durch eine inhärente oder erworbene niedrige Antigenproteinexpression und/oder eine Entkopplung der antigenpräsentierenden Signalübertragung in Tumorzellen oder der Tumormikroumgebung und der Immunaktivierung verursacht werden. Unabhängig von den Resistenzmechanismen ist es möglich, dass die direkte Aktivierung der angeborenen Immunität eine Immunantwort auslöst, die in der Lage ist, die Tumorresistenz gegenüber Immun-Checkpoint-basierten Therapien zu überwinden8.

Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Therapien, die die angeborene Immunität nutzen, ein vielversprechendes Antitumorpotenzial aufweisen9. In einer Reihe von Studien induziert Salmonella typhimurium, ein begeißeltes fakultatives intrazelluläres Bakterium, in präklinischen Modellen eine Tumorregression10,11,12,13,14,15,16,17. Aufbauend auf diesem Konzept laufen derzeit Therapieversuche mit Salmonellenarten (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT03762291). Die therapeutischen Wirkungen von Salmonellen werden wahrscheinlich durch die Antigenität der Bakterien und die Aktivierung der immunvermittelten Erkennung pathogenassoziierter molekularer Muster durch den Wirt durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs)14,18,19,20 gesteuert. Es überrascht nicht, dass viele TLR-Agonisten nachweislich eine Antitumoraktivität hervorrufen21,22,23,24. Insbesondere die Behandlung mit bakteriellem Flagellin, einem TLR5-Agonisten25, führt zu starken Antitumorreaktionen in verschiedenen Xenotransplantatmodellen für Dickdarm-, Brust- und Prostatakrebs sowie in einer Reihe von spontanen Tumormodellen der Maus23,26,27,28,29,30, 31. Interessanterweise korrelieren höhere Tlr5-Expressionsniveaus mit einem verbesserten Überleben bei Brust-, Lungen- und Eierstockkrebspatientinnen32. Obwohl die genauen Mechanismen der TLR5-vermittelten Antitumorwirkungen noch geklärt werden müssen, ist bekannt, dass TLR5 angeborene Immunantworten gegen bakterielles Flagellin25 vermittelt, wahrscheinlich durch Aktivierung entzündungsfördernder Signalwege, einschließlich NF-κB26,32,33. Interessanterweise kann TLR5 auch die adaptive Immunaktivierung vermitteln, indem es als co-stimulierender Rezeptor auf CD4+-T-Zellen fungiert, analog zur co-stimulierenden Rolle von CD28 bei der Aktivierung naiver CD4+-T-Zellen34. Daher ist es möglich, dass die Antitumorreaktionen eine Nebenwirkung der Immunantwort des Wirts auf Flagellin sind. Die TLR5-vermittelte Immunantwort hat zur Erforschung von Flagellin-abgeleiteten Reagenzien geführt, die für die klinische Anwendung geeignet sind. CBLB502 (Entolimod) ist ein rekombinantes Flagellin-Proteinfragment aus Salmonella enterica, das als TLR5-Agonist und Aktivator der NF-κB-Entzündungsreaktion fungiert35,36. In einer Reihe präklinischer Studien zeigte die Behandlung mit CBLB502 antitumorale und antimetastatische Wirkungen durch Aktivierung von Komponenten des angeborenen Immunsystems37,38,39,40,41. Die sichere systemische Verabreichung von CBLB502 wurde bei Nagetieren, nichtmenschlichen Primaten und Menschen nachgewiesen35,42,43 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT01527136), ein potenziell bedeutender Fortschritt im Vergleich zur Behandlung mit Agonisten anderer Mitglieder der TLR-Familie Kontext der Krebstherapie44,45,46 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT00960752). Hier untersuchten wir Kombinationen von TLR5-Agonisten und Immun-Checkpoint-Therapie (ICT) unter Verwendung des immunogenen 4T1-Brustkrebsmodells für solide Tumoren und des schwach immunogenen B16-F10-Melanomtumormodells, beides hochaggressive Krebsarten und refraktär gegenüber Standardtherapien47,48,49. Jeder Nachweis von Langzeitüberlebenden in diesen Modellen würde als Fortschritt angesehen werden, der weiterer Übersetzungsbemühungen würdig wäre.

Um die durch Flagellen und CBLB502 vermittelte NF-κB-Aktivierung von 4T1-Brustkarzinomzellen zu bewerten, haben wir 4T1-Zellen stabil mit einem κB5:IκBɑ-FLuc-Transkriptionsreporter transfiziert, der aus einer verketteten κB5-Promotorregion besteht, gefolgt vom biolumineszierenden IκBɑ-FLuc-Fusionsreportergen50 ,51. Dieser Reporter liefert eine Anzeige des endogenen Liganden-induzierten IκBɑ-Abbaus und der Produktion von neuem IκBɑ-FLuc-Fusionsprotein51, wodurch ein dynamisches Zweiphasensignal erzeugt wird. Im Zytoplasma bindet und inaktiviert IκBɑ NF-κB-Dimere. Die Bindung von Flagellin (oder CBLB502) an TLR5 auf der Zelloberfläche initiiert die IKK-vermittelte Kinaseaktivität und die anschließende Phosphorylierung, Ubiquitinierung und gezielte Steuerung des proteasomalen Abbaus von endogenem IκBɑ sowie dem Reporterfusionsprotein32,51. Wie durch diesen Mechanismus erwartet, führte dies zu einer Verringerung der Biolumineszenzaktivität während der ersten 100 Minuten in mit Flagellin behandelten Kulturen (Abb. 1a, roter Pfeil) und den ersten 80 Minuten in mit CBLB502 behandelten Kulturen (Abb. 1b, roter Pfeil). . Anschließend wandern die freigesetzten NF-κB-Dimere in den Zellkern und binden an die κB5-Promotorregion des Reporters, wodurch die Transkription und Translation neuer biolumineszierender Fusionsproteine ​​initiiert wird. Dies führte zu einem Anstieg des Biolumineszenzsignals in der zweiten Phase (Abb. 1a, b, grüne Pfeile), das nach einer ausreichenden Zeitspanne in einen homöostatischen Zustand zurückkehrte, wie zuvor bei anderen NF-κB-aktivierenden Liganden beobachtet . Insgesamt führte die Inkubation von 4T1-Zellen mit Flagellin oder CBLB502 zu einem konzentrationsabhängigen Abbau und anschließender Resynthese des IκBα-FLuc-Fusionsreporters, was den Zyklus der NF-κB-Signalübertragung widerspiegelt (Abb. 1a, b). Die halbmaximale wirksame Konzentration (EC50) für Flagellin und CBLB502 betrug in dieser Zelllinie >104 ng/ml bzw. 3,1 ng/ml, was direkt die erhöhte Wirksamkeit von CBLB502 zur Aktivierung des NF-κB-Signalwegs belegt (Abb. 1c, d).

4T1-Zellen, die pκB5:IκBαFLuc stabil exprimieren, wurden mit dem angegebenen Liganden bei t = 0 stimuliert und die Biolumineszenzaktivität wurde 4 Stunden lang alle 5 Minuten abgebildet. Die Daten werden als normalisierte Photonenflusswerte angezeigt (durchschnittlicher Fold-Initialwert, Fold-Vehikel). a 4T1-Zellen, die pκB5:IκBαFLuc stabil exprimieren, wurden mit steigenden Flagellinkonzentrationen behandelt: 1 ng/ml (n = 7), 10 ng/ml (n = 2), 50 ng/ml (n = 2), 100 ng/ml ( n = 7), 500 ng/ml (n = 7), 750 ng/ml (n = 2), 1 μg/ml (n = 7), 2,5 μg/ml (n = 7), 3 μg/ml ( n = 5), 4 μg/ml (n = 5), 5 μg/ml (n = 7), 7,5 μg/ml (n = 5), 10 μg/ml (n = 7) und TNFα 20 ng/ ml (n = 7). Fehlerbalken stellen SEM für die angegebene Anzahl unabhängiger Experimente dar. b 4T1-Zellen, die pκB5:IκBαFLuc stabil exprimieren, wurden mit steigenden CBLB502-Konzentrationen behandelt: 0,1 ng/ml (n = 3), 0,5 ng/ml (n = 3), 1 ng/ml (n = 3), 1,5 ng/ml (n = 3), 2,5 ng/ml (n = 3), 5 ng/ml (n = 3), 10 ng/ml (n = 3), 25 ng/ml (n = 3), 100 ng/ml (n = 3), 1 μg/ml (n = 3) und TNFα 20 ng/ml (n = 3). Fehlerbalken stellen SEM für die angegebene Anzahl unabhängiger Experimente dar. c Die halbmaximale effektive Konzentration (EC50) von Flagellin in 4T1-Zellen beträgt in diesem Modell >104 ng/ml. d Die halbmaximale effektive Konzentration (EC50) von CBLB502 in 4T1-Zellen beträgt in diesem Modell etwa 3,1 ng/ml.

Die CBLB502-Aktivierung der entzündungsfördernden NF-κB-Signalisierung wird durch TLR535 vermittelt, einen bekannten Aktivator des angeborenen Immunsystems25. Da CBLB502 ein starker Aktivator des NF-κB-Signals in 4T1-Karzinomzellen ist (Abb. 1b, d), haben wir getestet, ob CBLB502 ausreicht, um stimulierende Veränderungen im Zytokinprofil der 4T1-Zellen hervorzurufen. Wir haben Proteinarrays von 62 Mauszytokinen gemessen, die als Reaktion auf eine Behandlung über Nacht mit CBLB502 (1 µg/ml) von 4T1-Reporterzellen in konditionierte Medien sezerniert wurden. Ergänzende Abbildung 1a identifizierte viele hochregulierte Zytokine, die die angeborene Immunität aktivieren (in der Reihenfolge der Mehrfachkontrolle): SCF (97-fach), L-Selektion (29-fach), CCL11 (7-fach), IL-3 und sein Rezeptor IL-3RB (4- bzw. 7-fach), CCL9 (7-fach), CCL20 (6-fach), (IL-12 p40/p70 (5-fach), CCL2 (5-fach), Leptin-R (4-fach), CCL3 (4-fach), IGFBP-5 (3-fach), CCL19 (3-fach) und TNF-α (2-fach), während einige breitere immunregulatorische Funktionen ausüben, wie z. B. VEGF (3-fach), G-CSF (2-fach) und IL-2 (3-fach) (Ergänzungstabelle 1). CXCL13 (0,3-fach), CXCL12 (0,3-fach), IL-6 (0,3-fach) CD40 (0,4-fach) und IL-4 (0,6-fach) zeigten verringerte Werte (ergänzende Abbildung 1a und ergänzende Tabelle 1). Unter diesen Zytokinen zeigten CXCL1, CXCL5 und CCL2 einen statistisch nachweisbaren Anstieg im Vergleich zu die Vehikelkontrolle (zweischwänzig, p ≤ 0,05) (ergänzende Abbildung 1b). Es ist bemerkenswert, dass diese Zytokine bekanntermaßen Chemoattraktoren für Komponenten der angeborenen Immunität wie Neutrophile und Monozyten sind 53, 54, 55, 56. Insgesamt wurde durch die Inkubation von CBLB502 (1 µg/ml) das Zytokin-Signalprofil der Zelle neu programmiert, indem viele proinflammatorische und angeborene Immunität rekrutierende Zytokine hochreguliert wurden.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Verabreichung von Flagellin oder CBLB502 in einem syngenen dreifach negativen Brustkrebs-4T1-Tumormodell in vivo Antitumorreaktionen hervorrufen könnte. Brustzellkarzinome wurden bei BALB/c-Mäusen (5–6 Wochen alt) durch orthotope Injektion von 4T1-FUGW-FL-Tumorzellen in das rechte vierte Brustfettpolster erzeugt. Das Tumorwachstum jeder Maus wurde wöchentlich mithilfe von Biolumineszenzbildgebung (BLI) und Dickenmessungen des Tumorvolumens beurteilt (ergänzende Abbildung 2a – h). Eine Woche nach der orthotopen Injektion wurde ein Biolumineszenzsignal festgestellt, was die erfolgreiche Tumorimplantation bestätigt. Die Tumoren waren tastbar und zeigten zwei Wochen nach der orthotopen Injektion ein starkes Biolumineszenzsignal, was auf ein starkes Tumorwachstum hinweist. Anschließend wurden die Mäuse in vier verschiedene Behandlungskontrollen randomisiert: Vehikelkontrolle, ICT (Anti-PD-1 und Anti-CTLA-4), Flagellin- oder CBLB502-Behandlung und Flagellin oder CBLB502 in Kombination mit ICT-Behandlung in der angegebenen Dosis (Tabelle 1). und Versandart (Ergänzungstabelle 2).

Das Gesamtüberleben aus vier unabhängigen Experimenten ist in Abb. 2a dargestellt. Alle Mäuse unter Vehikelkontrolle (n = 25) oder unter reiner IKT-Behandlung (n = 23) starben am Ende der Studie, was den IKT-Refraktärstatus des 4T1-Brustkrebsmodells bestätigt. Bemerkenswert ist, dass eine mit Vehikel behandelte Maus mithilfe der ROUT-Methode als Ausreißer identifiziert wurde, weil in Woche 2 vor Beginn der Behandlung ein niedriger Photonenfluss gemessen wurde, und aus der Studie ausgeschlossen wurde. Bei intratumoraler Behandlung mit Flagellin allein (10 µg/Maus-Anfangsdosis) (n = 22) (ein Überlebender, p = 0,06, Log-Rank-Test) und bei intratumoraler Behandlung mit Flagellin + ICT (n = 22) wurden tumorfreie Mäuse beobachtet. drei Überlebende, p = 0,001, Log-Rank-Test) (Abb. 2a). Mäuse unter Vehikelkontrolle und Kontrollen, die nur mit Flagellin behandelt wurden, zeigten ein stetiges Biolumineszenzsignal mit einem Anstieg des Tumorvolumens (ergänzende Abbildung 2a, c). Interessanterweise zeigten ICT-behandelte Mäuse (nur ICT oder Flagellin + ICT-behandelte Mäuse) eine Woche nach Beginn der Behandlung einen starken Rückgang der Biolumineszenzsignale (ergänzende Abbildung 2b, d, linkes Feld); Die Abnahme der Biolumineszenzsignale ging jedoch nicht mit einer allgemeinen Abnahme des Tumorvolumens einher (ergänzende Abbildung 2b, d, rechtes Feld). Mindestens zwei Möglichkeiten könnten für diese Beobachtung verantwortlich sein: Tumorzelltod, begleitet von einem Anstieg des zellulären Immuninfiltrats, oder selektiver Verlust oder Stummschaltung der Biolumineszenzkassette. Obwohl sich diese Ergebnisse nicht gegenseitig ausschließen, deuten sie insgesamt auf einen IKT-induzierten Umbau in der Tumormikroumgebung mit zahlreichen Infiltraten von Immunzellen hin, der per se keinen Hinweis auf das Überleben gab.

eine Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von BALB/c-Mäusen, denen in Woche 0 orthotope 4T1 FUGW-FL fluoreszierende und biolumineszierende Reporterzellen implantiert wurden und die von Woche 2 bis Woche 4 mit Flagellin mit oder ohne ICT behandelt wurden. Mäuse, die mit Vehikelkontrolle (PBS) behandelt wurden ( n = 25), ICT (n = 23), Flagellin (n = 22) und Flagellin + ICT-Behandlung (n = 22) wurden verglichen. Die Behandlung mit Flagellin + ICT-Behandlung hatte im Vergleich zur Behandlung mit Vehikelkontrolle einen statistisch signifikanten Effekt auf das Überleben (p = 0,0002, Log-Rank-Test; p = 0,003, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test). Die Behandlung nur mit IKT zeigte im Vergleich zur Behandlung mit Vehikelkontrolle auch einen statistisch signifikanten Effekt auf das Überleben (p = 0,01, Log-Rank-Test; p = 0,03, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test). Allerdings waren alle mit IKT behandelten Mäuse in der achten Woche tot. Die Behandlung nur mit Flagellin zeigte keinen erkennbaren Unterschied (p = 0,06, Log-Rank-Test; p = 0,08, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test) im Vergleich zur Behandlung mit Vehikelkontrolle. (b) Eine Kombinationsbehandlung mit CBLB502 (niedrige Dosis) und ICT verbessert das Überleben. Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von BALB/c-Mäusen, denen orthotope fluoreszierende und biolumineszierende 4T1 FUGW-FL-Reportertumorzellen in Woche 0 implantiert und von Woche 2 bis Woche 4 mit CBLB502 (niedrige Dosis) mit oder ohne ICT behandelt wurden. Mäuse, die mit Vehikelkontrolle behandelt wurden (PBS) (n = 22), ICT (n = 25), CBLB502 (niedrige Dosis) (n = 30) und CBLB502 (niedrige Dosis) + ICT (n = 30) wurden verglichen. Die Behandlung CBLB502 (niedrige Dosis) + ICT hatte im Vergleich zur Behandlung mit Vehikelkontrolle einen statistisch nachweisbaren Effekt auf das Überleben (p = 0,002, Log-Rank-Test; p = 0,001, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test). Die Behandlung mit IKT allein zeigte keinen erkennbaren statistischen Unterschied beim Log-Rank-Test (p = 0,1), zeigte jedoch einen erkennbaren statistischen Unterschied beim Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test (p = 0,04). Die alleinige Behandlung mit CBLB502 (niedrige Dosis) zeigte keinen erkennbaren statistischen Unterschied (p = 0,8, Log-Rank-Test; p = 0,3 Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test). c Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von C57BL/6J-Mäusen, denen am Tag 0 B16-F10-Zellen implantiert und drei Tage nach der Tumorimplantation mit CBLB502 mit oder ohne ICT behandelt wurden. Verglichen wurden Mäuse, die mit Vehikelkontrolle (PBS) (n = 20), ICT (n = 15), CBLB502 (n = 14) und CBLB502 + ICT-Behandlung (n = 39) behandelt wurden. Die Behandlung mit CBLB502 + ICT-Behandlung hatte im Vergleich zur Behandlung mit Vehikelkontrolle einen statistisch signifikanten Effekt auf das Überleben (p = 0,003, Log-Rank-Test; p = 0,01, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test). d Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von BALB/c Tlr5+/+ oder Tlr5−/− Mäusen, denen in Woche 0 orthotope 4T1 FUGW-FL fluoreszierende und biolumineszierende Reportertumorzellen implantiert und mit Vehikelkontrolle (PBS) behandelt wurden (jeweils n = 7). Fahrzeugkohorte), ICT (n = 2 und n = 4 für Tlr5+/+ bzw. Tlr5-/- Mäuse), CBLB502 (n = 2 und n = 5 für Tlr5+/+ bzw. Tlr5−/− Mäuse) und CBLB502 +ICT-Behandlung (n = 10, für jede CBLB502 + ICT-Kohorte) wurden verglichen. Tlr5+/+-Mäuse, die mit CBLB502 (niedrige Dosis) + ICT behandelt wurden, hatten im Vergleich zu Tlr5+/+-Mäusen, die mit Vehikelkontrolle behandelt wurden, einen statistisch nachweisbaren Effekt auf das Überleben (p < 0,001, Log-Rank-Test; p < 0,01, Gehan-Breslow-Wilcoxon). Test) oder Tlr5–/– Mäuse, die mit CBLB502 (it) + ICT behandelt wurden (p < 0,001, Log-Rank-Test; p < 0,001, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test). Mit Vehikelkontrolle behandelte Tlr5+/+-Mäuse zeigten einen nachweisbaren statistischen Unterschied im Überleben im Vergleich zu mit Vehikelkontrolle behandelten Tlr5-/-Mäusen (p < 0,03, Log-Rank-Test; p < 0,03, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test).

Angesichts der Tatsache, dass CBLB502 eine größere Wirksamkeit und Wirksamkeit bei der Aktivierung des NF-κB-Signals als Flagellin zeigte (Abb. 1b, d) und dass CBLB502 angeborene immunaktivierende Zytokine stimulierte/rekrutierte (ergänzende Abb. 1a, b und ergänzende Tabelle 1), haben wir getestet ob eine intratumorale Behandlung mit CBLB502 (niedrige Dosis) eine stärkere Antitumorreaktion hervorrufen könnte als eine intratumorale Behandlung mit Flagellin. Das Gesamtüberleben aus vier unabhängigen Experimenten (Ergänzungstabelle 2) ist in Abb. 2b dargestellt. Eine Maus aus der Vehikelkontrollgruppe (n = 22) war am Ende des Experiments unerwartet tumorfrei. Diese Maus zeigte in den ersten zwei Wochen nach der Tumorimplantation ein vergleichbares Biolumineszenzsignal, was darauf hinweist, dass ausreichend Zellen für das Tumorwachstum implantiert wurden (ergänzende Abbildung 2e, Maus 20). Bemerkenswert ist jedoch, dass im Verlauf des Experiments kein tastbarer Tumor entdeckt wurde, was es wahrscheinlich macht, dass die Maus die Tumorzellen sequestrierte, bevor der Tumor ein signifikantes Wachstum entwickeln konnte. Die Behandlung mit CBLB502 allein (niedrige Dosis) (n = 30) führte zu einem stetigen Biolumineszenzsignal und Tumorwachstum ohne Überlebende (ergänzende Abbildung 2g). Die alleinige ICT-Behandlung (n = 25) führte zu einer tumorfreien Maus (ergänzende Abbildung 2f, Maus 23) und einer Maus, die zunächst auf die Behandlung anzusprechen schien, später jedoch langsam einen Tumor entwickelte (ergänzende Abbildung 2f, Maus 18). ). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen zeigten IKT-behandelte Mäuse (nur IKT oder CBLB502 (niedrige Dosis) + IKT-Behandlungen) eine Woche nach Beginn der Behandlung einen starken Rückgang des Biolumineszenzsignals (ergänzende Abbildung 2f, h), was mit einem signifikanten anfänglichen Verlust übereinstimmt von 4T1-Tumorzellen. Am wichtigsten ist, dass CBLB502 (niedrige Dosis) + ICT-Behandlung zu 20 % tumorfreien Mäusen führte (n = 30) (p = 0,001, Log-Rank-Test; p = 0,001, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test) (Abb. 2b) .

Wir haben eine höhere intratumorale CBLB502-Dosis (CBLB502-Hochdosis) getestet, die mit der Dosis vergleichbar ist, die Mäusen in der Flagellin-Behandlungskohorte verabreicht wurde (Tabelle 1). In drei unabhängigen Experimenten (Ergänzungstabelle 2) führte die Behandlung mit CBLB502 (hohe Dosis) zu einer tumorfreien Maus in der Behandlung nur mit CBLB502 (hohe Dosis) (n = 15) und ohne Überlebende in einer der anderen Behandlungen (Vehikel (n = 19), ICT (n = 17), CBLB502 (hohe Dosis) + ICT (n = 15)) (Ergänzende Abbildung 3a – e). Interessanterweise zeigte eine weitere Maus in der Behandlung nur mit CBLB502 (hohe Dosis) ein verzögertes Tumorwachstum (ergänzende Abbildung 3d, Maus 3). Der einsame Überlebende (ergänzende Abbildung 3d, Maus 5) zeigte einen statistisch nachweisbaren Unterschied im Überleben gegenüber seiner Vehikelkontrolle (p = 0,01, Log-Rank-Test; p = 0,01, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test).

Wir untersuchten weiter, ob die systemische Verabreichung von CBLB502 (niedrige Dosis) über intraperitoneale (ip) Injektionen eine ähnliche Reaktion wie die intratumorale Verabreichung von CBLB502 (niedrige Dosis) hervorrufen könnte. In zwei unabhängigen Experimenten (ergänzende Abb. 4a–e, ergänzende Tabelle 2) führte die ip + ICT-Behandlung mit CBLB502 (niedrige Dosis) zu 10 % Langzeitüberlebenden (n = 20) (p = 0,01, Log-Rank-Test; p = 0, 01, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test) (Ergänzende Abbildung 4e, Mäuse 1 und 5). Während die Vehikelkontrolle (n = 8) und CBLB502 allein (niedrige Dosis, ip-Verabreichung, n = 20) zu keinen Langzeitüberlebenden führten (ergänzende Abbildung 4b, d), führten ICT-behandelte Mäuse (n = 6) zu einem Überlebenden Langzeitüberlebender in diesem Experiment (p = 0,4 und Log-Rank-Test; p = 0,3 Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test im Vergleich zur Vehikelkontrolle) (Ergänzende Abb. 4c, Maus 3).

Wir untersuchten weiter, ob eine Kombinationsbehandlung von CBLB502 und ICT auch bei einem schwach immunogenen Tumor, wie dem B16-F10-Melanomtumormodell, Antitumorreaktionen hervorrufen könnte. Melanomtumoren wurden bei C57BL/6J (6–9 Wochen alt) durch subkutane Injektion von B16-F10-Tumorzellen in die rechte Rückenflanke erzeugt. Drei Tage nach der Tumorimplantation wurden die Mäuse randomisiert vier verschiedenen Behandlungskontrollen zugeteilt: Vehikelkontrolle, ICT (Anti-PD-1 und Anti-CTLA-4), CBLB502-Behandlung und CBLB502 in Kombination mit ICT-Behandlung in der angegebenen Dosis und Verabreichungsmethode (Ergänzungstabelle 3). Das Gesamtüberleben aus vier unabhängigen Experimenten ist in Abb. 2c dargestellt. Das Fortschreiten des Tumors wurde für jede Maus alle zwei Wochen anhand von Messschiebermessungen des Tumorvolumens beurteilt (ergänzende Abbildung 5). Von vier unabhängigen Experimenten entwickelte eine Vehikelkontrollmaus während der Versuchsdauer keinen tastbaren Tumor (ergänzende Abbildung 5a, Maus 18). Alle ausschließlich mit IKT behandelten Mäuse (n = 15) starben am Ende der Studie (ergänzende Abbildung 5b), was den IKT-Refraktärstatus des B16-F10-Melanom-Tumormodells ohne Zugabe eines Impfstoffs bestätigt57. Nur eine Maus in der CBLB502-Behandlung (n = 14) entwickelte am Ende der Studie keinen Tumor (ergänzende Abbildung 5c, Maus 14). Die Überlebenskurven zeigten jedoch keinen erkennbaren statistischen Unterschied zur Vehikelkontrollgruppe (p = 0,5, Log-Rank-Test; p = 0,3, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test) (Abb. 2c). Die Kombinationsbehandlung mit CBLB502 und ICT führte in Woche 78 der Studie zu 25 % tumorfreien Mäusen (n = 39) (p = 0,001, Log-Rank-Test; p = 0,003, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test) (Abb. 2c und ergänzende Abb. 5d). Somit verbesserte die Kombinationsbehandlung mit TLR5-Agonisten und ICT das Überleben in vivo bei zwei unabhängigen ICT-refraktären Tumormodellen.

Wir haben getestet, ob TLR5-Wirtsrezeptoren notwendig sind, um die Antitumorreaktion hervorzurufen, die bei Mäusen beobachtet wurde, die mit CBLB505 in Kombination mit ICT-Behandlungen behandelt wurden (Abb. 2d)). Tlr5+/+- und Tlr5–/–-Mäuse wurden mit 4T1 FUGW-FL (Tlr5+/+) herausgefordert und wie in früheren Experimenten behandelt (Ergänzungstabelle 4). Die Kaplan-Meier-Überlebenskurve aus zwei unabhängigen Experimenten ist in Abb. 2d dargestellt. Alle Mäuse unter Vehikelkontrolle starben am Ende der Studie (ergänzende Abbildungen 6a, e). Es ist jedoch bemerkenswert, dass die Überlebenskurve für Tlr5–/–-Vehikel-Kontrollmäuse (n = 7) einen signifikanten Unterschied zur Überlebenskurve von Tlr5+/+-Vehikel-Kontrollmäusen (n = 7) aufwies (p = 0,03, Log-Rank). Test; p = 0,03, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test) (Abb. 2d). Alle mit ICT oder CBLB502 behandelten Mäuse in beiden Kohortengruppen waren in Woche 6 tot (ergänzende Abbildungen 6b, c, f und g). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen (Abb. 2b) führten Tlr5+/+-Mäuse, die mit CBLB502 (niedrige Dosis) + ICT-Behandlungen behandelt wurden, zu 20 % tumorfreien Mäusen (n = 10) (Abb. 2d und ergänzende Abb. 6d, Mäuse 2 und 4). Dagegen starben alle Tlr5–/–-Mäuse, die mit CBLB502 (niedrige Dosis) + ICT-Behandlungen behandelt wurden, am Ende der Studie (n = 10) (p = 0,001, Log-Rank-Test; p = 0,01, Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test). , verglichen mit Tlr5+/+-Mäusen, die mit CBLB502 (niedrige Dosis) + ICT-Behandlungen behandelt wurden (Abb. 2d und ergänzende Abb. 6h). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TLR5-Wirtsrezeptoren für die Antitumorreaktionen notwendig sind, die bei Mäusen beobachtet werden, die mit CBLB502- und ICT-Behandlungen behandelt wurden.

Mäuse, die eine vollständige Tumorregression zeigten, wurden ohne zusätzliche Therapie durch orthotopische Injektionen von 4T1 FUGW-FL-Zellen in das gegenüberliegende (linke) vierte Brustfettpolster erneut herausgefordert (Ergänzungstabelle 5). Abbildung 3a zeigt das Gesamtüberleben aus dem Re-Challenge-Experiment. Alle unbehandelten tumornaiven, tumortragenden und altersentsprechenden Kontrollmäuse starben in der sechsten Woche, was das aggressive Potenzial der Tumorzellkohorte bestätigte, wohingegen 80 % der erneut infizierten Mäuse mindestens 60 Wochen nach dem Tumor tumorfrei waren Implantation (Abb. 3a–c). Eine erneut belastete Maus wurde aus der in Abb. 3a gezeigten Überlebenskurve ausgeschlossen, da die Todesursache nicht mit der Tumorimplantation zusammenhing (ergänzende Abb. 2e – Vehikel, Maus 20, starb während der Blutentnahme zur Zytokinprofilierung in Woche drei). Darüber hinaus zeigte diese Maus eine Woche nach der erneuten Belastung ein vergleichbares Biolumineszenzsignal wie andere Mäuse mit erneuter Belastung (ergänzende Abbildung 7), was auf eine erfolgreiche Tumorimplantation hinweist. Allerdings wurden danach in den ersten drei Wochen des Experiments keine Biolumineszenzsignale oder ein tastbarer Tumor mehr festgestellt, was darauf hindeutet, dass die Maus wahrscheinlich die Implantation eines 4T1-FUGW-FL-Tumors ablehnte. Dennoch deuten diese Ergebnisse insgesamt darauf hin, dass die beobachteten heilenden Wirkungen wahrscheinlich auf das erworbene Gedächtnis für die Antitumorimmunität zurückzuführen sind.

eine Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von BALB/c-Mäusen, die mindestens 18 Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation überlebten und keine Anzeichen eines Tumors zeigten, aber auf der Gegenseite erneut mit orthotopen 4T1-FUGW-FL-Tumorzellen infiziert wurden (links) viertes Brustfettpolster (n = 15) und altersentsprechende tumornaive Kontrollmäuse (n = 14). Allen Mäusen wurden in Woche 0 4T1-FUGW-FL-Tumorzellen injiziert, und die Tumoren konnten ohne therapeutische Intervention wachsen. Erneut herausgeforderte Mäuse zeigten eine Überlebensrate von 80 % (p = 0,0001, Log-Rank-Test; p = 0,0001 Gehan-Breslow-Wilcoxon). b Tumorgröße tumornaiver Mäuse (n = 14), gemessen durch Biolumineszenzbildgebung (Gesamtphotonenfluss, linkes Feld) und Dickenmessungen (Tumorvolumen, rechtes Feld). Alle Tumor-naiven, tumorprovokierten Mäuse starben in der 6. Woche. c Tumorgröße der erneut infizierten Mäuse (n = 15), gemessen durch Biolumineszenzbildgebung (Gesamtphotonenfluss, linkes Feld) und Dickenmessungen (Tumorvolumen, rechtes Feld). Nur drei tumorüberlebende Mäuse starben aufgrund der Tumorlast: Ergänzende Abb. 2f-Maus 23 (ICT), Ergänzende Abb. 2h-Maus 1 (CBLB502 1 µg (it) + ICT) und Ergänzende Abb. 3d-Maus 5 (CBLB502). 10 µg (es)) und (Ergänzungstabelle 5). Alle anderen Mäuse, die den Tumor überlebten, waren mindestens 60 Wochen lang nach der erneuten Behandlung mit dem orthotopen Tumor tumorfrei.

Um unser Verständnis der Reaktionsmechanismen zu erweitern und Veränderungen zu charakterisieren, die durch ICT- und CBLB502-Therapien allein oder in Kombination hervorgerufen werden, haben wir 32 periphere Blutzytokine von altersentsprechenden tumorfreien Mäusen (gesunde Mäuse, keine Tumorimplantation) und 4T1 untersucht FUGW-FL-tumortragende Mäuse in unseren Behandlungskohorten: tumortragend, Vehikelkontrolle; tumortragend, Behandlungsversagen; und tumortragend, auf die Behandlung ansprechend (ergänzende Abb. 8a–e), während Woche 3 (Abb. 4a) und Woche 10 (ergänzende Abb. 8f) und Wochen 5 bis 7 (Abb. 4c) für 4T1-FUGW-FL-Tumor- Nur Kohorten mit Mäusen. Bemerkenswert ist, dass tumorfreie gesunde Mäuse zwischen Woche 3 und 10 der Studie eine variable Expression von Zytokinen zeigten, was wahrscheinlich physiologische Veränderungen in der Zytokinexpression widerspiegelt (Abb. 4a und ergänzende Abb. 8f, tumorfreie Mäuse).

eine Heatmap von 32 peripheren Blutzytokinen von tumorfreien Mäusen und Mäusen, die drei Wochen nach der orthotopen Tumorimplantation mit 4T1-FUGW-FL-Tumoren infiziert waren: tumorfreie Mäuse (gesunde Mäuse, kein Tumor implantiert); Tumortragende Mäuse, Vehikel (PBS)-Kontrolle (Nichtüberlebende), Tumortragende Mäuse, fehlgeschlagene Behandlung (Nichtüberlebende) und Tumortragende Mäuse, Langzeitüberlebende. b Vulkandiagramm, das den nachweisbaren statistischen Unterschied zwischen Zytokinen im peripheren Blut drei Wochen nach der orthotopen Tumorprovokation hervorhebt. c Heatmap von 32 peripheren Blutzytokinen von Mäusen, die 5 bis 7 Wochen nach der Tumorimplantation mit 4T1-FUGW-FL-Tumoren infiziert wurden: tumortragende Mäuse, Vehikel (PBS)-Kontrolle (Nichtüberlebende) in Woche 5; tumortragende Mäuse, fehlgeschlagene Behandlung (Nichtüberlebende), Wochen 5 bis 7; und tumortragende Mäuse, Langzeitüberlebende in den Wochen 6 und 7. d Vulkandiagramm, das den nachweisbaren statistischen Unterschied zwischen peripheren Blutzytokinen hervorhebt, die zwischen 5 und 7 Wochen nach der orthotopen Tumorprovokation entnommen wurden. e Heatmap von 32 peripheren Blutzytokinen von Mäusen, die erneut mit dem 4T1-FUGW-FL-Tumor infiziert wurden: Tumor-naive Mäuse, tumortragende (nicht überlebende), Tumor-überlebende Mäuse, nach erneuter Belastung fehlgeschlagene (nicht-überlebende) und Tumor-überlebende Mäuse, Re-Challenge-Überlebender (Langzeitüberlebende), aufgenommen drei Wochen nach der orthotopen 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation. f Vulkandiagramm, das den nachweisbaren statistischen Unterschied zwischen Zytokinen aus dem peripheren Blut hervorhebt, die drei Wochen nach der erneuten Belastung mit dem orthotopen Tumor gemessen wurden.

Aus unserer Analyse gingen vier Profile hervor. Erstens ist es bemerkenswert, dass die Konzentrationen des Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors (G-CSF), einem Zytokin, das an der Proliferation und Differenzierung von Granulozyten und Neutrophilen58 beteiligt ist und mit einem schlechteren Überleben bei Gebärmutterhalskrebs, nichtkleinzelligem Lungenkrebs, Dickdarmkrebs und Melanomen verbunden ist. und Hautkrebs59,60,61,62,63, zeigten einen statistischen Anstieg bei tumortragenden Mäusen, Vehikelkontrolle im Vergleich zu tumorfreien Mäusen drei Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation (Abb. 4a, b, linkes Feld, Ergänzungstabelle 6) und eine statistische Abnahme im Vergleich zu tumortragenden Mäusen, die auf die Behandlung ansprachen (Langzeitüberlebende) (Abb. 4a, b, mittleres Feld, Ergänzungstabelle 6). Obwohl es keinen statistischen Unterschied zwischen tumortragenden Mäusen, bei denen die Behandlung fehlschlug (Nichtüberlebende), und tumortragenden Mäusen, die auf die Behandlung ansprachen (Langzeitüberlebende), drei Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation (Abb. 4a, b, rechtes Feld, Ergänzungstabelle 6), gab es in den Wochen 5 bis 7 einen statistischen Rückgang zwischen diesen beiden Gruppen von Mäusen (Abb. 4c, d, rechtes Feld, Ergänzungstabelle 7). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigten tumortragende Mäuse, die auf die Behandlung reagierten, in den Wochen 5 bis 7 auch einen statistischen Rückgang im Vergleich zu tumortragenden Mäusen, Vehikelkontrolle (Abb. 4c, d, mittleres Feld, Ergänzungstabelle 7). Zweitens zeigte CXCL5, ein Chemokin, das an der Rekrutierung von myeloischen Suppressorzellen (MDSCs) in die Tumormikroumgebung beteiligt ist64,65,66,67 und mit einem schlechten Überleben bei Nieren-, Leber-, Bauchspeicheldrüsen- und Gebärmutterhalskrebs assoziiert ist68, einen statistischen Rückgang der Tumor- tragende Mäuse, die auf die Behandlung reagierten (Langzeitüberlebende), verglichen mit tumortragenden Mäusen, die drei Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation die Behandlung versagten (Nichtüberlebende) (Abb. 4a, b, rechtes Feld, Ergänzungstabelle 6). Drittens stellen wir fest, dass in den Wochen 5 bis 7 nach der Tumorimplantation IL-15, ein entzündungsförderndes und immunaktivierendes Zytokin, das das Überleben, die Differenzierung, Proliferation und Aktivierung von natürlichen Killerzellen (NK), CD8+-T-Zellen und B Zellen69,70,71,72,73,74,75, zeigten einen statistischen Anstieg bei tumortragenden Mäusen, die auf die Behandlung reagierten (Langzeitüberlebende), im Vergleich zu tumortragenden Mäusen, bei denen die Behandlung versagte (Nichtüberlebende) (Abb. 4c, d, rechtes Feld, Ergänzungstabelle 7) oder mit tumortragender Mäusevehikelkontrolle (Abb. 4c, d, mittleres Feld, Ergänzungstabelle 7). Im Gegensatz dazu gab es keinen statistischen Unterschied zwischen tumortragenden Mäusen, Vehikelkontrolle, und tumortragenden Mäusen, bei denen die Behandlung fehlschlug (Nichtüberlebende) (Abb. 4c, d, linkes Feld, Ergänzungstabelle 7). Viertens zeigten tumortragende Mäuse, die auf die Behandlung reagierten, einen allgemeinen Anstiegstrend für immunaktivierende Zytokine im Vergleich zu tumortragenden Mäusen, bei denen die Behandlung in den Wochen 5 bis 7 nach der Tumorimplantation fehlschlug, auch wenn dies aufgrund der Zwei-Wege-ANOVA-Tests statistisch nicht signifikant war: GM-CSF (11-fach)76, IL-2 (15-fach)77, IL-13 (8-fach)78, IFN-γ (7-fach)79 und CCL3 (vierfach)80. Bemerkenswert ist, dass CXCL1, ein Chemokin, das mit der Tumorimmunsuppression assoziiert ist81, einen vierfachen Anstieg gegenüber tumortragenden Mäusen zeigte, bei denen die Behandlung fehlschlug (Ergänzungstabelle 7). IL-10, ein Zytokin, das an der Immunsuppression durch Hemmung von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und der Aktivierung von immunsuppressiven T-reg-Zellen82 beteiligt ist, zeigte bei Mäusen, die auf die Behandlung ansprachen, einen zweifachen Rückgang im Vergleich zu Mäusen, bei denen die Behandlung versagte ( Ergänzungstabelle 7). Interessanterweise werden IL-10-Antagonisten derzeit als Antitumor-Immuntherapie in Kombination mit TLR-Agonisten und anderen immunstimulierenden Behandlungen untersucht83. Schließlich zeigten tumortragende Mäuse, die auf die Behandlung reagierten (Langzeitüberlebende), im Vergleich zu tumorfreien Kontrollmäusen einen statistischen Anstieg von IL-1α, IL-15, CXCL5 und IL-12 p40, was auf ein ausgeprägtes immunaktivierendes System hinweist Zytokinprofil zehn Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation (ergänzende Abbildung 8f, g).

Die Zytokine von erneut infizierten und tumornaiven Mäusen wurden drei Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Implantation getestet. Mäuse, die mindestens 60 Wochen nach der erneuten Exposition tumorfrei waren (Mäuse, die den Tumor überlebten, Mäuse, die die erneute Exposition überlebten), zeigten ein charakteristisches Zytokinprofil im Vergleich zu Mäusen, die der erneuten Exposition unterzogen wurden, aber Tumore entwickelten (Mäuse, die den Tumor überlebten, der erneuten Exposition). (Abb. 4a). Interessanterweise zeigte IL-15, ähnlich wie frühere Ergebnisse mit Challenge-Mäusen (Abb. 4c, d), einen statistischen Anstieg bei Langzeitüberlebenden (Tumor-überlebende Mäuse, Re-Challenge-Überlebende) im Vergleich zu Mäusen, die einer erneuten Challenge unterzogen wurden, dies aber taten nicht überleben (tumorüberlebende Mäuse, Versagen bei erneuter Belastung) (Abb. 4e, f, rechtes Feld, Ergänzungstabelle 8) und bei tumornaiven, tumortragenden Mäusen, die ebenfalls nicht überlebten (Abb. 4e, f, mittleres Feld, Ergänzung). Tabelle 8). Interessanterweise zeigten Mäuse mit erneuter Belastung, die nicht überlebten (Tumorüberlebende Mäuse, Versagen bei erneuter Belastung), im Vergleich zu tumornaiven Mäusen mit Tumoren ebenfalls einen statistischen Anstieg (Abb. 4e, f, linkes Feld, Ergänzungstabelle 8), aber in geringerem Maße als Langzeitüberlebende (Tumorüberlebende Mäuse, Re-Challenge-Überlebende). Darüber hinaus waren die G-CSF-Spiegel bei Langzeitüberlebenden (Mäuse mit Tumorüberlebenden, Überlebende mit erneuter Belastung) tendenziell niedriger (19-fach verringert) im Vergleich zu tumornaiven, tumortragenden Mäusen (Nichtüberlebende) (Ergänzungstabelle). 8), aber diese Werte blieben hinter der statistischen Signifikanz zurück (zweifaktorielle ANOVA). Mäuse, die erneut einer Herausforderung unterzogen wurden, aber nicht überlebten (Tumorüberlebende Mäuse, Versagen bei erneuter Herausforderung), zeigten zu diesem Zeitpunkt ähnliche G-CSF-Spiegel wie tumornaive, tumortragende Mäuse (Ergänzungstabelle 8). Darüber hinaus sind aus unserer Analyse vier Profile hervorgegangen. Erstens, Zytokine, die sowohl bei Mäusen mit Re-Challenge-Versagen als auch bei Mäusen mit Re-Challenge-Überlebenden hochreguliert waren, jedoch mit einem weitaus größeren Anstieg bei Re-Challenge-Überlebenden: LIF (5-fach im Vergleich zu 420-fach), CXCL1 (3-fach im Vergleich). mit 120-fach), IL-2 (7-fach im Vergleich zu 260-fach), IL-7 (100-fach im Vergleich zu 3700-fach), IL-12 p70 (10-fach im Vergleich zu 240-fach), CCL4 (3-fach im Vergleich zu 58-fach), CCL11 (3-fach im Vergleich zu 27-fach), CCL3 (3-fach im Vergleich zu 20-fach), IL-1α (4-fach im Vergleich zu 22-fach), IL -10 (55-fach im Vergleich zu 210-fach), IL-1β (3-fach im Vergleich zu 6-fach), CXCL2 (8-fach im Vergleich zu 17-fach), IL-4 (21-fach im Vergleich zu 41-fach) 1-fach), IL-9 (4-fach im Vergleich zu 7-fach) und M-CSF (40-fach im Vergleich zu 62-fach) (Ergänzungstabelle 8). Zweitens: Zytokine, die in beiden Gruppen herunterreguliert waren, jedoch in größerem Ausmaß in der Kohorte mit Re-Challenge-Versagen: IL-3 (0,4 im Vergleich zu einem Rückgang um 0,7), IL-5 (0,3 im Vergleich zu einem Rückgang von 0,5) und CXCL10 (0,3 im Vergleich). mit 0,5 Abnahme) (Ergänzungstabelle 8). Drittens zeigten Zytokine eine unterschiedliche Regulation zwischen den beiden Kohorten: IL-12 p40 (Abnahme um 0,4 im Vergleich zu einem zweifachen Anstieg), TNFα (Abnahme um 0,5 im Vergleich zu einem zweifachen Anstieg), IL-6 (Abnahme um 0,7 im Vergleich zu einem zweifachen Anstieg). (Ergänzungstabelle 8). Viertens änderten sich Zytokine, die sich in einer Population nicht veränderten, in einer anderen jedoch schon: Überlebende Mäuse, die erneut einer Belastung ausgesetzt waren, regulierten IL-13 (53-fach), CXCL9 (12-fach), IFN-γ (9-fach) und CCL5 (dreifach) hoch -Fach), wohingegen Mäuse mit Re-Challenge-Versagen diese Zytokine nicht mehr als um das Zweifache hochregulierten. CXCL5 zeigte einen Rückgang um 0,8 bei Langzeitüberlebenden, aber keine Veränderung bei Mäusen, die nicht überlebten. IL-17 zeigte einen zweifachen Anstieg bei Mäusen, die nicht überlebten, jedoch keine Veränderung bei Langzeitüberlebenden (Ergänzungstabelle 8). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse ein ausgeprägtes adaptives immunaktivierendes Zytokinprofil bei den Mäusen, die das Re-Challenge-Experiment überlebten.

Um die Auswirkungen von CBLB502- und ICT-Therapien allein oder in Kombination weiter aufzuklären, untersuchten wir Veränderungen in der Mikroumgebung des Tumorimmunsystems als Reaktion auf diese Therapien und fragten, ob Veränderungen bei der Infiltration von Immunzellen mit einer erhöhten Überlebenswahrscheinlichkeit korrelieren. Wir verwendeten eine einzigartige Strategie, die auf Biolumineszenzsignalen basiert, als prognostisches Instrument für die Überlebensergebnisse von Mäusen, die drei Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation zur Tumorextraktion und anschließenden Tumorimmuninfiltrat-Durchflusszytometrie-Profilierung eingeschläfert wurden, und zwar zu einem Zeitpunkt vor den Ergebnissen für einzelne Mäuse wäre bekannt, aber das Biolumineszenzsignal wäre prädiktiv.

Tumorvolumen- und BLI-Messungen waren nützliche Instrumente zur Beurteilung des Tumorfortschritts in präklinischen Modellen84,85,86,87. Darüber hinaus wurden BLI-Messungen verwendet, um die Wirksamkeit der Behandlung in verschiedenen Tiermodellen zu bewerten88,89. Daher nutzten wir Gesamtüberlebensdaten und Tumorprogressionsmessungen (Abb. 2a, b und ergänzende Abb. 2), um das prädiktive Potenzial für das Überlebensergebnis von Biolumineszenz (Gesamtphotonenfluss) und/oder Tumorvolumenmessungen 3 Wochen nach 4T1 FUGW zu bewerten -FL-Tumorimplantation. Die Fläche unter der Kurve (AUC) der ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic) wurde verwendet, um die Gesamtdiagnosegenauigkeit jeder Messung zu bestimmen, wobei der Datensatz basierend auf ihrem Überleben bis zu 12 Wochen in „Überlebende“ und „Nicht-Überlebende“ dichotomisiert wurde90. Abbildung 5a zeigt, dass BLI (Log10-Gesamtphotonenfluss in Woche 3) den besten Vorhersagewert hatte (AUC = 0,75; 95 %-KI 0,6 bis 0,9; p ≤ 0,001), dicht gefolgt von der Tumorgröße (AUC = 0,74, 95 %-KI 0,6 bis). 0,9; p ≤ 0,001) (Abb. 5b). Steigungen des Tumorvolumens von Woche 2 bis 3 wurden ebenfalls als Quantifizierer verwendet, erreichten jedoch keine Signifikanz (AUC = 0,6, 95 %-KI 0,5 bis 0,7, p ≥ 2) (Abb. 5c). Es gab auch eine geringe Korrelation zwischen Log BLI und Tumorlast, was darauf hindeutet, dass jede Messung zusätzliche Informationen liefern könnte. Die prädiktive diagnostische Genauigkeit von BLI-Messungen für Überlebensergebnisse zeigte, dass Mäuse mit höheren BLI-Messungen eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit hatten und dass Mäuse mit niedrigeren BLI-Messungen eine erhöhte Überlebenswahrscheinlichkeit hatten.

ROC-Kurven zum Vergleich von Sensitivität und Spezifität für das Gesamtüberleben durch a Biolumineszenz (Gesamtphotonenfluss) in Woche 3, b Tumorvolumen in Woche 3 und c Tumorvolumengefälle zwischen Woche 2 und 3. d Behandlungsdiagramm für eingeschläferte Mäuse zur Tumorimmunisierung Profilierung.

Anschließend untersuchten wir nach drei Wochen die Veränderungen der Immun-Mikroumgebung des Tumors als Reaktion auf die Behandlungen. Tumortragende 4T1-FUGW-FL-Mäuse wurden eine Woche lang mit CBLB502 oder ICT allein oder in Kombination behandelt und drei Wochen nach der Tumorimplantation zur Tumorernte eingeschläfert, wie in Abb. 5d, Schema und Ergänzungstabelle 9 gezeigt. Die Tumoren wurden enzymatisch verdaut und vorbereitet für die Durchflusszytometrie-Analyse durch Färbung mit Antikörpern, die entweder auf myeloische Zellen abzielen: dendritische Zellen, Monozyten (Ly6C+), Monozyten (Ly6C+, Ly6G+), Makrophagen, M1-ähnliche Makrophagen und M2-ähnliche Makrophagen oder lymphoide Zellen: B-Zellen, NK-Zellen, CD3+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen und T-Regs-Zellen (Ergänzungstabellen 10, 11). Myeloide und lymphoide Zellen wurden wie in der Ergänzungstabelle 12 beschrieben identifiziert.

In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen von 4T1-Tumoren stellten 91,92 myeloische Zellen (CD11b+-Zellen) die Mehrheit der Immunzellen (CD45+-Zellen) dar, die in Tumorproben von Vehikelkontrollmäusen vorhanden waren (ergänzende Abbildung 9; Myeloidzellen-Panel, Vehikelkontrolle). Tumorproben behandelter Mäuse zeigten jedoch einen Trend zu einer erhöhten Variabilität der Anzahl myeloischer Zellen (ergänzende Abbildung 9; Gruppe myeloischer Zellen, behandelte Kontrollen). Dieser Trend könnte anhaltende Immunreaktionen bei behandelten Mäusen widerspiegeln. Tatsächlich sind die allgemeinen Veränderungen der Tumorimmunlandschaft bei behandelten Mäusen heterogen und könnten auf eine Immunaktivierung hinweisen.

Zunächst beobachteten wir, dass ein Anstieg des Anteils an Monozyten (Ly6C+) und Monozyten (Ly6C+, Ly6G+) mit einem erhöhten BLI-Signal korrelierte (r = 0,6, p < 0,001 und r = 0,7, p < 0,001) (Abb. 6a, b). , dunkelviolette und braune Pfeile). Darüber hinaus korrelierte auch ein Anstieg des Anteils myeloischer Zellen, dendritischer Zellen, M1-ähnlicher Makrophagen, T-reg und NK-Zellen mit einem erhöhten BLI-Signal, erreichte jedoch keine statistische Signifikanz (r = 0,4, p > 0,08; r = 0,3). p > 0,08; r = 0,2, p > 0,4; r = 0,01, p > 0,9; r = 0,2, p > 0,4) (Abb. 6a, b). Bemerkenswert ist der Anstieg der Anzahl Ly6C+- und Ly6C+-, Ly6G+-Monozyten bei tumortragenden Mäusen mit erhöhtem BLI-Signal. Es ist bekannt, dass 4T1-Tumoren starke Induktoren monozytischer MDSCs93,94 sind, einer heterogenen Population schlecht differenzierter myeloischer Zellen. Es ist bekannt, dass MDSCs die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen unterdrücken, die Funktionen natürlicher Killerzellen (NK) beeinträchtigen, immunsuppressive T-Reg-Zellen induzieren und tumorfördernde Entzündungszustände fördern, indem sie die Wechselwirkung zwischen Tumorzellen, Mastzellen und Makrophagen regulieren95. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen fanden wir einen erhöhten Anteil an CD3+ T-Zellen und CD4+ T-Zellen, der umgekehrt mit einem erhöhten BLI-Signal korrelierte (r = –0,6; p ≤ 0,01 und r = –0,5; p ≤ 0,01) (Abb. 6a, b, grün). und hellviolette Pfeile). Darüber hinaus zeigten Anstiege bei CD8+-T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen und M2-ähnlichen Makrophagen eine umgekehrte Korrelation mit einem erhöhten BLI-Signal, obwohl die Korrelationen keine statistische Signifikanz erreichten (r = –0,3; p > 0,3, r = –0,3; p > 0,2, r = −0,06; p > 0,9; r = −0,4; p > 0,8) (Abb. 6a, b). Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf einen Wechsel des Zustands der Tumorimmunmikroumgebung von Immunsuppression zu Immunaktivierung bei Mäusen mit niedrigeren BLI-Signalen hin, was eine anschließende heilende Antitumorreaktion auslöst.

a Myeloisches (oberes Bild) und lymphoides (unteres Bild) Tumorimmuninfiltratprofil von Vehikel- und behandelten Mäusen, zugeordnet einer Log-BLI-Messung, die 3 Wochen nach der 4T1-FUGW-FL-Tumorimplantation und vor der Tumorextraktion durchgeführt wurde. b Vulkandiagramm, das die Korrelation zwischen Immuninfiltrat und Log BLI hervorhebt. Die vertikale Linie markiert negative und positive Spearman-R-Korrelationswerte. Die Identitätslinie zeigt p = 0,05 an. Grüne, hellviolette, braune und dunkelviolette Pfeile markieren CD3+-T-Zellen, CD4+-T-Zellen, Monozyten (Ly6C+, Ly6G+) bzw. Monozyten (Ly6C+) in den Feldern A und B.

Schließlich versuchten wir weiter, das diagnostische Potenzial des Log (BLI)-Signals zu bestätigen, indem wir das im Blut übertragene Zytokinprofil von Langzeitüberlebensmäusen (Abb. 4a, b) mit Mäusen mit Immunprofil (Ergänzung Abb. 8a – e und Ergänzung) verglichen Tabellen 13–16). In Übereinstimmung mit dem peripheren Blutzytokinprofil von Langzeitüberlebensmäusen korrelierten eingeschläferte Mäuse mit einem niedrigeren Log-Signal (BLI) mit einem verringerten G-CSF (r = –0, 8; p ≤ 0, 001) (ergänzende Abbildung 10a, b). Bemerkenswert ist, dass CXCL5, das zuvor als überlebensschädlich identifiziert wurde (Abb. 4b), keine statistisch signifikanten Unterschiede aufwies: (r = –0,2; p > 0,5) (Ergänzende Abb. 10a, b). Es ist jedoch möglich, dass die Stichprobengröße die Fähigkeit, statistische Unterschiede zu erkennen, einschränkte.

Das 4T1-Mammakarzinom ist ein robustes Mausmodell zur Untersuchung von dreifach negativem Brustkrebs beim Menschen, der hochinvasiv, metastasierend und resistent gegen Immun-Checkpoint-Therapien ist96,97. Hier berichten wir: (1) die erfolgreiche Behandlung des etablierten ICT-refraktären murinen 4T1-Mammakarzinoms und des schwach immunogenen und ICT-refraktären B16-F10-Melanom-Tumormodells durch die Kombination von Standard-ICT plus wirksamen angeborenen immunaktivierenden TLR5-Agonisten, (2) Wirts-TLR5-Rezeptoren sind für ein verbessertes Überleben bei Mäusen notwendig, die mit einer Kombination aus ICT und TLR5-Agonisten bei 4T1-tumortragenden Mäusen behandelt wurden. (3) Immunbezogene Behandlungen lösten bei den meisten Langzeitüberlebenden ein Immungedächtnis gegen Tumorantigene aus. (4) Systemisches Zytokin Profile implizierten die Aktivierung sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunität als Reaktion auf die Behandlung. (5) CXCL5 und G-CSF können als Biomarker für positive Reaktionen auf die Behandlung fungieren. (6) IL-15 weist auf die Aktivierung der adaptiven Immunität bei der Auslösung von a hin Die kurative Anti-Tumor-Reaktion (7) war ein neuartiger Ansatz, der das nicht-invasive BLI-Signal als Mittelwert-Biomarker für das Fortschreiten des Tumors in Woche 3 nutzte und als Vorhersageinstrument für Überlebensergebnisse in Woche 7 oder später diente, was dann verwendet wurde Identifizieren Sie Veränderungen in der mittleren Tumorimmunmikroumgebung bei einzelnen Mäusen, die am besten mit einer erhöhten Überlebenswahrscheinlichkeit korrelieren, und (8) Abnahmen von Monozyten (Ly6C+) und Monozyten (Ly6C+, Ly6G+), begleitet von einem Anstieg von CD3 + T-Zellen und CD4 + T-Zellen steuerten wahrscheinlich den Zustand der Tumormikroumgebung von der Immunsuppression zur Immunaktivierung. Da bakterielles Flagellin der native Ligand für TLR5 ist, liefern unsere Studien insgesamt weitere mechanistische Einblicke in die Zusammenhänge zwischen IKT-Reaktion und Mikrobiota98,99,100,101.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf eine neue Therapiestrategie hin, die sowohl angeborene als auch adaptive Komponenten des Immunsystems nutzt, um eine dauerhafte Antitumorreaktion hervorzurufen. Einerseits wurde gezeigt, dass aus Bakterien gewonnenes Flagellin durch Bindung an TLR5 eine gezielte Antitumorreaktion auslöst und eine Kaskade von Signalen auslöst, die über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB32 eine entzündungsfördernde Reaktion hervorrufen. Hier haben wir zunächst gezeigt, dass CBLB502, ein starker Aktivator der NF-kB-Signalwege, in vitro ausreicht, um eine TLR5-vermittelte immunogene Zytokinantwort in Tumorzellen auszulösen. Angesichts der Tatsache, dass Mängel in der Antigenpräsentation vielen Resistenzmechanismen gegen IKT zugrunde liegen, kann die Hypothese aufgestellt werden, dass ein wirksamer Aktivator der angeborenen Immunität die Tumorhomöostase modulieren und den Zustand der Tumormikroumgebung von der Immunsuppression zur Immunaktivierung verschieben kann (Abb. 7). Mehrere Beweislinien stützen dieses Modell. Erstens erhöhte nur die Behandlung mit Flagellen oder CBLB502 in Kombination mit ICT das Überleben bei Mäusen mit hoch ICT-refraktären 4T1- und B16-F10-Tumoren, wohingegen Monotherapien mit Flagellin, CBLB502 oder ICT keine signifikanten heilenden Wirkungen zeigten. Zweitens spiegelten die Zytokinprofile im peripheren Blut von 4T1-tumortragenden Mäusen, die auf die Behandlung ansprachen und eine vollständige Tumorregression zeigten, eine konzertierte Antitumorreaktion wider. Drittens reagierten Tlr5-/-Mäuse nicht auf eine Kombinationstherapie mit ICT plus TLR5-Agonist, was darauf hindeutet, dass TLR5-Rezeptoren des Wirts für ein verbessertes Überleben notwendig sind. Während gezeigt wurde, dass Mäuse, die Tumorzellen ohne TLR5 tragen, nicht auf die Behandlung mit Flagellin ansprechen26, muss noch untersucht werden, ob Flagellen und CBLB502 auch auf die Tumorzellen einwirken können, um im Rahmen einer Kombinationsbehandlung mit ICT eine heilende Immunantwort auszulösen . Darüber hinaus muss noch geklärt werden, ob die TLR5-Rezeptoren des Wirts hauptsächlich auf Komponenten der Achse der angeborenen Immunität einwirken oder ob sie auch direkt auf Komponenten der adaptiven Immunität einwirken könnten, um dauerhafte Immunantworten im Zusammenhang mit ICT hervorzurufen34. Viertens stießen fast alle überlebenden Mäuse, die einer erneuten Belastung ausgesetzt wurden, denselben Tumor ab, was auf eine adaptive Gedächtnisreaktion gegen Tumorzellen schließen lässt. Fünftens stimmten die peripheren Zytokinprofile der Mäuse, die erneut einer Herausforderung ausgesetzt waren und den Tumor abwiesen, mit einer starken adaptiven immunaktivierenden Reaktion überein. Schließlich stimmten Veränderungen im Tumorimmuninfiltrat bei Mäusen mit erhöhter Überlebenswahrscheinlichkeit mit einer Immunaktivität überein, die zu einer heilenden Antitumorreaktion führte.

Die Tumor-Mikroumgebung von BALB/c-Mäusen, denen 4T1 FUGW-FL implantiert wurde, ist stark von Immunsuppressorzellen infiltriert, die eine Pro-Tumor-Mikroumgebung begünstigen (linkes Feld). Eine starke Aktivierung der angeborenen Immunität durch TLR5-Agonisten in Kombination mit ICT-Behandlungen, die auf PD-1 und CTLA-4 abzielen, führt zu einem systemischen Anstieg des immunaktivierenden Zytokins IL-15 und einer Verringerung der immunsuppressiven Zytokine G-CSF und CXCL5. Gleichzeitig führt ein Rückgang der Monozyten (Ly6C+) und Monozyten (Ly6C+, Ly6G+), begleitet von einem Anstieg der CD3+ T-Zellen und CD4+ T-Zellen, zu einer Immunaktivierung und einer Antitumorreaktion (rechtes Feld).

Der bemerkenswerte Anstieg der im Blut übertragenen G-CSF-Proteinspiegel bei tumortragenden Mäusen, bei denen die Behandlung entweder fehlschlug oder die als tumortragende unbehandelte Kontrollen dienten, ließ darauf schließen, dass G-CSF als potenzieller Biomarker untersucht werden könnte. Umgekehrt deutete ein niedriger G-CSF-Serumspiegel bei tumortragenden Mäusen, die auf die Behandlung reagierten oder eine langfristige Tumorimmunität entwickelten, auf einen Nutzen als prädiktiver Marker für das Ansprechen auf die Behandlung hin. Diese Ergebnisse erhöhen die Vorsicht bei der Verwendung von G-CSF zur Vorbeugung von Neutropenie bei Krebspatienten. Obwohl eine kürzlich durchgeführte Metaanalyse einen gewissen Nutzen der unterstützenden G-CSF-Therapie für das Gesamtüberleben von Patienten unter Chemotherapie zeigte, zeigen die Daten auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung sekundärer maligner Erkrankungen102. Die G-CSF-Therapie im Kontext der IKT muss noch erforscht werden. Ebenso ist es bemerkenswert, dass Langzeitüberlebende Mäuse im Vergleich zu Mäusen, bei denen die Behandlung fehlschlug (Nichtüberlebende), statistisch signifikante Rückgänge bei CXCL5 zeigten, was darauf hindeutet, dass CXCL5 auch als Biomarker für das Ansprechen auf die Behandlung und/oder als potenzielles therapeutisches Ziel untersucht werden kann .

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Erfolg der Immun-Checkpoint-Therapie bei der Auslösung langanhaltender Heilreaktionen gegen verschiedene Krebsarten bei Untergruppen von Patienten lohnenswerte Bemühungen zur Erhöhung der Zahl der Patienten darstellt, die auf diese Art der Behandlung ansprechen. Aktivatoren von TLR5 wie Flagellin und CBLB502 könnten in Kombination mit ICT neue therapeutische Möglichkeiten für zuvor nicht ansprechbare Patienten bieten.

Salmonella typhimurium Flagellin (FLA-ST) wurde von Invivogen bezogen. CBLB502 war ein Geschenk von Cleveland Biolabs, Inc. Die monoklonalen Antikörper 9D9 (Anti-CTLA-4) und RPM1-14 (Anti-PD-1) wurden von BioX Cell gekauft und in Stammlösungen mit 6,5 bzw. 6,7 mg/ml aufbewahrt vor Gebrauch bei 4 °C lagern. d-Luciferin (d-Luc) (BioGold), das Substrat für Glühwürmchen-Luciferase, wurde in einer 30 mg/ml-Lösung phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gehalten. Matrigel wurde von Corning bezogen und bei –20 °C gehalten.

4T1-Mammakarzinomzellen (ATCC) bei 95 % Konfluenz wurden mit 10 µg pκB5:IκBα-FLuc52 und 3 µg pIRES-puro-Plasmid-DNA unter Verwendung von Fugene 6 (Roche) in 10-cm-Schalen (BD Bioscience) co-transfiziert. Die Kulturen wurden bei 37 °C inkubiert und nach 24 Stunden wurde das Medium durch frisches RPMI, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, ersetzt. 24 Stunden später wurden die Zellen in mehreren Verdünnungen in Medien aufgeteilt, die 0,5 µg/ml Puromycin enthielten, um auf stabile Transformanten zu selektieren. Nach zwei Wochen wurden isolierte Zellkolonien fotografiert, um die Expression des Reportergens zu bestätigen, und biolumineszierende Kolonien wurden geerntet und vermehrt. Reporterzellen wurden kontinuierlich in Gegenwart von 0,5 µg/ml Puromycin kultiviert, um die Expression des Reporterplasmids aufrechtzuerhalten.

4T1-Mammakarzinom-Reporterzellen FUGW103, stabil transfiziert mit dem EF1α:FLuc-Plasmid, das konstitutive fluoreszierende und biolumineszierende Dual-Imaging-Reporterzellen (FUGW-FL) produziert, wurden gemäß ATCC-Protokollen kultiviert und unter Selektion mit 0,5 µg/ml Puromycin104 gehalten. B16-F10-Elternzellen wurden gemäß den ATCC-Protokollen105 kultiviert.

4T1 κB5:IκBα-FLuc-Reporterzellen (7000 Zellen) wurden zu einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Eine Stunde vor der Bildgebung wurden die Zellmedien abgesaugt und durch RPMI mit L-Glutamat (4T1-Zellen), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 150 µg/ml D-Luciferin (BioGold), ersetzt. Die Zellen wurden in einem IVIS 100-Bildgebungssystem abgebildet, wobei die Bilder 4 Stunden lang alle 5 Minuten aufgenommen wurden, sofern nicht anders angegeben. Die Zellen wurden durch einen beheizten Tisch (37 °C) und einen 5 % CO2-Luftstrom in der Bildgebungskammer gehalten. Die Aufnahmeparameter waren: Aufnahmezeit 60 Sekunden; Binning, 4–8; Filter, offen; f Stopp, 1; Sichtfeld: 12–23 cm. Enthaltene Stimuli: TNFα (20 ng/ml) (F&E-Systeme); Flagellin (verschiedene Konzentrationen von 1 μg/ml bis 0,1 ng/ml); CBLB502 (verschiedene Konzentrationen von 1 μg/ml bis 0,1 ng/ml); und nukleasefreies Wasser (nur Vektorkontrolle) wurde in drei Vertiefungen gegeben. Biolumineszenz-Photonenflussdaten (Photonen/s) stellen den Mittelwert von dreifachen Vertiefungen für die angegebene Anzahl unabhängiger Experimente dar und wurden durch ROI-Messungen (Region of Interest) mit Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences) analysiert. Die Daten wurden in Excel (Microsoft Corp.) importiert, gemittelt und sowohl auf Anfangswerte (t = 0) (Fold-Initial) als auch auf fahrzeugbehandelte Kontrollen (Fold-Vehicle) normalisiert, um sie in dynamischen Diagrammen darzustellen50. Die normalisierten Ergebnisse aus wiederholten Experimenten wurden für jeden Zeitpunkt gemittelt und die Ergebnisse als normalisierter Photonenfluss über der Zeit grafisch dargestellt, wobei die y-Achse eine log2-Skala hatte. Positive Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts für wiederholte Experimente dar.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des MD Anderson Cancer Center der University of Texas genehmigt; Protokoll 00001179-RN01. Weibliche BALB/c-Mäuse (4 Wochen alt) wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Das BALB/c Tlr5−/−-Paarungsmäusepaar war ein Geschenk von Joon Haeng Rhee, Chonnam National University Medical School, Südkorea106. BALB/c Tlr5−/− wurden von der Abteilung für Veterinärmedizin und Chirurgie des MD Anderson Cancer Center der University of Texas gezüchtet und gepflegt. Weibliche C57BL/6J (6–9 Wochen alt) wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Den Tieren wurde vor Beginn der Experimente mindestens eine Woche Zeit gegeben, sich an die Tierhaltung zu gewöhnen.

Mäuse, die den Endpunkt erreichten (moribunder Zustand oder mit einem Tumormaß in der Sagittal- oder Axialebene größer als 1,5 cm), wurden gemäß den Sterbehilfeprotokollen des MD Anderson Cancer Center der University of Texas IACUC eingeschläfert.

Ein Brustzellkarzinom-Allotransplantat wurde in BALB/c-Mäusen (5–6 Wochen alte Mäuse) durch orthotope Injektion von etwa 10.000 4T1 FUGW-FL-Zellen, gemischt mit Matrigel im Verhältnis 2:1, in das vierte Brustfettpolster etabliert. Das jeder Maus injizierte Gesamtvolumen betrug 30 μl.

Flagellin, CBLB502, 9D9 (Anti-CTLA-4) und RPM1-14 (Anti-PD-1) wurden in gefiltertem PBS suspendiert; Als Vehikelkontrolle wurde gefiltertes PBS verwendet. Zwei Wochen nach der orthotopen Injektion von 4T1 FUGW-FL-Zellen in das Brustfettpolster wurde jede Maus nach dem Zufallsprinzip in Gruppen eingeteilt, die Vehikelkontrolle (n = 45, insgesamt) oder nur eine Behandlung mit Flagellin (n = 22) oder nur CBLB502 (n) erhielten = 30), nur ICT (9D9 plus RPM1-14) (n = 37), Flagellin kombiniert mit ICT oder CBLB502 kombiniert mit ICT (n = 52). Flagellin oder CBLB502 wurde zwei Wochen lang alle zwei Tage verabreicht. Alle in verschiedene Behandlungsgruppen eingeteilten Mäuse zeigten in Woche 1 und Woche 2 nach der Implantation von 4T1-FUGW-FL-Tumorzellen nachweisbare Werte an Biolumineszenzsignalen, was das Vorhandensein von Tumoren vor Beginn der Behandlung bestätigt (ergänzende Abbildungen 2, 3b–e, 4b–). e, 6 und 8b–e). Am ersten Behandlungstag wurden 10 μg Flagellinlösung in 50 μl (PBS) oder 10 μg (hohe Dosis) oder 1 μg (niedrige Dosis) CBLB502-Lösung in 50 μl (PBS) intratumoral oder verabreicht intraperitoneale Injektion in bestimmte Tiere. Für jede weitere Behandlung wurden 2 μg Flagellinlösung in 50 μl (PBS) oder 2 μg (hohe Dosis) oder 200 ng (niedrige Dosis) CBLB502-Lösung in 50 μl (PBS) verwendet. ICT wurde an den Tagen 1, 3, 5 und 8 der Behandlung verabreicht. Am ersten Tag wurden Mäusen, die eine ICT-Behandlung erhielten, intraperitoneal 200 μg in 100 μL von 9D9 und RPM1-14 injiziert (insgesamt 200 μL pro Maus). An den folgenden Tagen wurden jeder Maus 100 μg in 100 μl jedes Antikörpers injiziert. An Tagen, an denen sowohl Flagellin als auch ICT verabreicht wurden, erhielten Vehikelkontrollmäuse zwei intraperitoneale Injektionen von 100 μl PBS oder eine intraperitoneale Injektion von 200 μl PBS und eine intratumorale Injektion von 50 μl PBS. An Tagen, an denen nur Flagellin verabreicht wurde, erhielten Vehikelmäuse nur eine intratumorale Injektion von 50 μl PBS, und an dem Tag, an dem nur ICT verabreicht wurde, erhielten sie nur zwei intraperitoneale Injektionen von 100 μl PBS oder eine intraperitoneale Injektion von 200 μl PBS.

Die Mäuse wurden wöchentlich mit dem PerkinElmer IVIS Spectrum Imaging System abgebildet, beginnend eine Woche nach der orthotopen Injektion von 4T1 FUGW-FL-Zellen in das Brustfettpolster. Die Mäuse wurden zu Beginn jeder Bildgebungssitzung gewogen und 165 μg D-Luciferin (zubereitet mit 30 mg/ml in PBS) wurden pro Gramm Maus intraperitoneal injiziert. Mäuse wurden zehn Minuten nach der Injektion von d-Luciferin50 abgebildet.

Genomische DNA von Tlr5+/+- und Tlr5–/–-Mäusen wurde durch Abschneiden der Schwanzspitze von Mäusen mit einer Länge von weniger als 3 mm erhalten. Schwanzproben wurden mit DirectPCR Lysis Reagent Tail (Viagen Biotech Inc) verarbeitet, gefolgt von PCR (ergänzende Abbildung 11a, b). Die Genomregion, die das Tlr5-Gen enthält, wurde unter Verwendung der folgenden Primer und PCR-Protokolle amplifiziert:

Tlr5-WT: 5′-CTA TCT GGC AAC CAG ATT CAC AGC CTC-3′

Tlr5-KO: 5′-CTA AAG CGC ATG CTC CAG ACT GCC TTG-3′

Tlr5-extra: 5′-CAG GTC GTT AAA TAT CCC AGG TGG AAG-3′

Anfängliche Denaturierung, 94 °C für 5 Minuten; Denaturierung, 94 °C für 1 Minute; Glühen, 62 °C für 1 Minute; Verlängerung, 72 °C für 1 Minute, 30 Zyklen, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung, 72 °C für 5 Minuten.

Bei C57BL/6J-Mäusen (Jackson Laboratory, 6–9 Wochen alte Mäuse) wurde durch subkutane Injektion von etwa 12.000 B16-F10-Zellen in die rechte Rückenflanke ein Melanomtumor etabliert. Das jeder Maus injizierte Gesamtvolumen betrug 50 μl Zellen, resuspendiert in RPMI 1640 mit L-Glutamin-Medium (Millipore Sigma).

Drei Tage nach der subkutanen Injektion von B16-F10-Zellen in die hintere rechte Flanke wurde jede Maus nach dem Zufallsprinzip in eine Gruppe eingeteilt, die eine Behandlung mit Vehikelkontrolle, nur CBLB502, nur ICT (9D9 plus RPM1-14) oder CBLB502 in Kombination mit ICT erhielt. CBLB502, 9D9 und RPM1-14 wurden in gefiltertem PBS suspendiert und gefiltertes PBS wurde als Vehikelkontrolle verwendet. CBLB502 wurde zwei Wochen lang alle zwei Tage verabreicht. Am ersten Behandlungstag wurde 1 μg in 50 μl CBLB502 als intratumorale Injektion an bestimmte Tiere verabreicht. Für jede weitere Behandlung wurden 200 ng in 50 μl CBLB502 verwendet. ICT wurde an den Tagen 1, 3, 5 und 8 der Behandlung verabreicht. Am ersten Tag wurden Mäusen, die eine ICT-Behandlung erhielten, intraperitoneal 200 μg in 100 μL von 9D9 und RPM1-14 injiziert (insgesamt 200 μL pro Maus). An den folgenden Behandlungstagen wurden jeder Maus 100 μg in 100 μl jedes Antikörpers injiziert. An Tagen, an denen sowohl CBLB502 als auch ICT verabreicht wurden, erhielten Vehikelkontrollmäuse eine intraperitoneale Injektion von 200 μl PBS und eine intratumorale Injektion von 50 μl PBS. An Tagen, an denen nur CBLB502 verabreicht wurde, erhielten Vehikelmäuse nur 50 μl intratumorale PBS-Injektionen, und an dem Tag, an dem nur ICT verabreicht wurde, erhielten sie nur 200 μl intraperitoneale PBS-Injektionen.

Das Tumorvolumen wurde bestimmt, indem die Länge (l, längstes Maß) und die Breite (w) für jeden Tumor mindestens einmal pro Woche mit einem Messschieber gemessen wurden, wobei die Standard-Dreiecksprismenformel für das Volumen verwendet wurde: V = (l × w2)/2.

4T1 FUGW-FL fluoreszierende und biolumineszierende Dual-Reporterzellen wurden in 100-mm-Gewebekulturplatten (BD) (750.000 Zellen pro Platte) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C mit RPMI, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, inkubiert. Am zweiten Tag wurden die Zellmedien abgesaugt und durch RPMI ohne 10 % hitzeinaktiviertes FBS ersetzt. Am dritten Tag wurden die Kulturen entweder mit CBLB502 bei 1 µg/ml oder PBS als Vektorkontrolle in dreifacher Ausfertigung behandelt. Am vierten Tag wurden die Medien in 15-ml-Röhrchen gesammelt und 10 Minuten lang bei 2000 U/min und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem Mouse Cytokine Antibody Array C Serie 1000 (RayBiotech) untersucht.

Seren von Mäusen in den Experimenten 6, 7 und 8 (Ergänzungstabelle 2) wurden durch submandibuläre Probenahme gewonnen. Man ließ die Proben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerinnen, zentrifugierte sie 10 Minuten lang bei 2000 × g bei Raumtemperatur und sammelte die Seren (obere Phase) in Eppendorf-Röhrchen. Seren von Mäusen in Experiment 9 (Ergänzungstabelle 2) wurden durch Saphena-Probenahme gewonnen. Die Proben wurden in Serumtrennröhrchen (Thermo-Fisher) gesammelt, 10 Minuten lang bei 4 ° C und 2000 × g zentrifugiert und die Seren (obere Phase) wurden in Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Alle Serumproben wurden bei –80 °C gelagert. Die Blutproben machten nicht mehr als 10 % des gesamten zirkulierenden Blutvolumens aus107.

Serumproben wurden im Antibody-Based Proteomics Core am Baylor College of Medicine, Houston, TX analysiert. Der Kern verwendete das Milliplex Mouse 32-Plex Cytokine Panel (Millipore), das die folgenden Zytokine enthielt: G-CSF, GM-CSF, CCL11, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17 , CXCL10, CXCL1-like, LIF, CXCL5, CCL2, M-CSF, CXCL9, CCL3, CCL4, CXCL2, CCL5, TNF-α, VEGF und entsprechende Kontrollen und Kalibrierungsstandards. Für Zytokine mit Werten oberhalb des Bereichs haben wir den höchsten beobachteten Wert für das entsprechende Zytokin angegeben, während wir für Werte unterhalb des Bereichs den niedrigsten Wert auf der Standardkurve geteilt durch die Hälfte angegeben haben108,109.

Tumore und Milzen wurden mit einer Schere oder Pinzette entfernt und gewichtet. Die Tumoren wurden in feine Stücke geschnitten und in RPMI-Medium (5 % FBS + 10 mM HEPES) überführt, das Kollagenase (0,2 mg/ml) (Clostridium histolyticum, Sigma) enthielt, und die Milzen wurden in PBS suspendiert. Die Tumoren wurden vor der Gewebezerstörung 30 Minuten lang leicht bei 37 °C geschüttelt. Milz- und Tumorgewebe wurden mit einem Zellsieb (70 µm Nylon) (Corning) unter Verwendung einer Spritze aufgebrochen. Das Nylonnetz wurde mehrmals mit Medium gespült. Die Proben wurden geschleudert (5 Minuten bei 1500 U/min) und 5 Minuten lang in 1 ml RBC-Lysepuffer (Sigma) resuspendiert und 2x mit Flusspuffer (Thermo Fisher) gewaschen. Die Zellen wurden gezählt (Nexelom Cellometer), vor der Lebend-/Totfärbung mit Zombie UV (Biolegend), 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 2x mit PBS gewaschen. Es folgten die Fc-Blockierung (CD16/CD32, BD Biosciences), die Antikörperfärbung und die Herstellung einfarbiger Kompensationskontrollen (Ultra Comp eBeads-Kompensationsperlen, Thermo Fisher). Die Proben wurden mit Folie abgedeckt und über Nacht bei 4 °C aufbewahrt. Die intrazelluläre Färbung wurde unter Verwendung von Permeabilisierungspuffer (eBioscience) in Verbindung mit dem Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer-Set (eBioscience) durchgeführt. Wo angezeigt, wurden Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) verwendet, um zwischen positiv und negativ gefärbten Zellen für FoxP3, Ly6G und Ly6C zu unterscheiden.

CD45 Brilliant Violet 650 (30-F11, Biolegend), CD11b Pe-Cy7 (M1/70, Biolegend), CD11c Brilliant Violet 711 (N418, Biolegend), F4/80 PE-dazzle 594 (BM8, Biolegend), Ly-6G APC-Fire 750 (1A8, Biolegend), Ly-6C Brilliant Violet 510 (HK1.4, Biolegend), CD80 Brilliant Violet 650 (16-10A1, Biolegend), CD163 PerCP-eFluor 710 (TNKUPL, Biolegend) und CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (Ergänzungstabelle 10).

CD45 Alexa Fluor 700 (30-F11, Biolegend), CD19 PerCP/Cy5 (6D5, Biolegend), CD3ε Brilliant Violet 650 (17A2, Biolegend), CD4 PerCP-Cy5.5 (GK1.5, Biolegend), CD49b PE-dazzle 594 (DX5, Biolegend), CD8a Brilliant Brilliant Violet 510 (53–6,7, Biolegend), FoxP3 Alexa 647 (3G3, Thermo-Fisher) und CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (Ergänzungstabelle 10) .

CD45 Alexa 700 (30-F11, Biolegend), CD11b PerCP/Cyanine5.5 (M1/70, Biolegend), CD11c Brilliant Violet 510 (N418, Biolegend), F4/80 Brilliant Violet 785 (BM8, Biolegend), Ly-6G PE/Cy7 (1A8, Biolegend), Ly-6C Brilliant Violet 605 (HK1.4, Biolegend), CD80 Brilliant Violet 421 (16-10A1, Biolegend), CD163 APC (S15049I, Biolegend) und CD285 PE (TLR-5). ) (ACT5, BD Biosciences) (Ergänzungstabelle 11).

CD45 Alexa 700 (30-F11, Biolegend), CD19 PerCP/Cy5.5 (1D3/CD19, Biolegend), CD3ε Brilliant Violet 510 (17A2, Biolegend), CD4 PE/Cy7 (GK1.5, Biolegend), CD49b BV421 ( DX5, Biolegend), CD8a Brilliant Brilliant Violet 711 (53–6,7, Biolegend), FoxP3 Alexa 647 (MF-14, Biolegend) und CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (Ergänzungstabelle 11).

Die Durchflusszytometrie wurde mit einem LSRII-Zytometer (Becton Dickinson) durchgeführt. Die anschließende Analyse wurde mit FlowJo 10.7.1 (FlowJo, Becton Dickinson) durchgeführt.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 8.0.0 für Windows, GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, durchgeführt. Das Gesamtüberleben wurde anhand der Kaplan-Meier-Kurven110 bewertet. Zum Vergleich der Überlebensraten zwischen den Behandlungen wurden der Log-Rank-Test (Mantel-Cox) und der Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test verwendet. Für die prädiktive Analyse wurden ROC-Kurven berechnet. Zweiwege-Anova- und Multi-T-Test-Vergleiche unter Verwendung der Holm-Sidak-Methode mit Alpha = 0,05 wurden verwendet, um nachweisbare statistische Unterschiede in In-vitro- und In-vivo-Zytokinstudien zu bestimmen. Der Pearson-Korrelationskoeffizient (r) wurde berechnet, um die Korrelation zwischen der Überlebenswahrscheinlichkeit und dem Anteil des Tumorimmuninfiltrats zu bewerten. Zur Bestimmung der nachweisbaren statistischen Signifikanz wurde ein zweiseitiger p-Wert ≤ 0,05 verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien, einschließlich der ergänzenden Daten 1, enthalten.

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Abteilung für Bildgebung von Krebssystemen, MD Anderson Cancer Center der Universität von Texas, Houston, TX, 77030, USA

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Joon Haeng Rhee

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CG, STG und DPW haben Experimente entworfen. CG und SW führten Experimente durch. CG, SW, STG, SG und DPW analysierten Daten. JHR hat ein Reagenz geschenkt. CG, STG und DPW haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript bearbeitet.

Korrespondenz mit David Piwnica-Worms.

Das MD Anderson Cancer Center der University of Texas hat eine Patentanmeldung für die in diesem Bericht beschriebenen Verbindungen und Methoden eingereicht (CG, STG und DPW, Erfinder). Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Shitao Li und Zhijuan Qiu.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gonzalez, C., Williamson, S., Gammon, ST et al. TLR5-Agonisten stärken die Anti-Tumor-Immunität und überwinden die Resistenz gegenüber einer Immun-Checkpoint-Therapie. Commun Biol 6, 31 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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Eingegangen: 20. Juni 2022

Angenommen: 23. Dezember 2022

Veröffentlicht: 12. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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