Klotho in Osx+

Signal Transduction and Targeted Therapy Band 7, Artikelnummer: 155 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Defekte des Kiefer- und Gesichtsknochens treten in der klinischen Praxis häufig auf. Ein klareres Verständnis des regulatorischen Netzwerks, das die Knochenbildung im Kiefer- und Gesichtsbereich steuert, wird die Entwicklung neuer Therapieansätze für die Knochenregeneration fördern. Der Signalweg des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF) ist entscheidend für die Entwicklung des maxillofazialen Knochens. Klotho, ein Typ-I-Transmembranprotein, ist ein wichtiger Bestandteil von FGF-Rezeptorkomplexen. Jüngste Studien haben das Vorhandensein einer Klotho-Expression im Knochen berichtet. Die Rolle von Klotho bei der Entwicklung und Reparatur des Schädels bleibt jedoch unbekannt. Hier verwenden wir eine genetische Strategie, um zu berichten, dass die Deletion von Klotho in Osx-positiven mesenchymalen Vorläufern zu einer signifikanten Verringerung der Osteogenese unter physiologischen und pathologischen Bedingungen führt. Klotho-defiziente mensenchymale Vorläufer unterdrücken auch die Osteoklastogenese in vitro und in vivo. Wir stellen fest, dass Klotho unter Bedingungen von Entzündungen und traumabedingtem Knochenverlust eine hemmende Funktion auf die entzündungsbedingte TNFR-Signalübertragung ausübt, indem er die Rankl-Expression abschwächt. Noch wichtiger ist, dass wir zum ersten Mal zeigen, dass Klotho im menschlichen Alveolarknochen vorhanden ist und sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen ein ausgeprägtes Expressionsmuster aufweist. Zusammenfassend identifizieren unsere Ergebnisse den Mechanismus, durch den Klotho, der in Osx+-mensenchymalen Vorläufern exprimiert wird, die Osteoblastendifferenzierung und Osteoklastogenese während der Bildung und Reparatur des Alveolarknochens im Unterkiefer steuert. Die Klotho-vermittelte Signalübertragung ist ein wichtiger Bestandteil des Umbaus und der Regeneration des Alveolarknochens. Es könnte auch ein Ziel für zukünftige Therapeutika sein.

Der Kiefer- und Gesichtsknochen hat entscheidende physiologische Funktionen, wie die Bildung des Gesichtsgerüsts, den Schutz des Verdauungs- und Atmungssystems und die Unterstützung benachbarter Weichteile und Zahnstrukturen.1 Knochendefekte im Kiefer- und Gesichtsbereich treten in der klinischen Praxis häufig auf. Zu den häufigsten Ursachen gehören Entzündungen, Traumata, Mundkrebs und angeborene Geburtsfehler.2 Die Behandlung von Defekten und die Regeneration von Knochen waren schon immer eine Herausforderung aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften, der ästhetischen Anforderungen des Gesichtsskeletts und der erheblichen körperlichen Veränderungen, die dazu führen können zu psychosozialer Belastung.3 Es gibt offensichtliche Unterschiede zwischen Kiefer- und Gesichtsknochen und den meisten anderen Knochen aufgrund ihres unterschiedlichen embryonalen Ursprungs, ihrer Knochenbildung und ihrer Struktur.4 Daher ist die Aufklärung der Mechanismen der Entwicklung und Reparatur des Kiefer- und Gesichtsskeletts von wesentlicher Bedeutung, um Innovationen bei therapeutischen Behandlungsstrategien zu ermöglichen von maxillofazialen Knochendefekten.

Der Signalweg des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF) ist für die Entwicklung des maxillofazialen Knochens von wesentlicher Bedeutung. Menschliche Genmutationen in FGF-Rezeptoren wurden als Ursachen für zahlreiche Anomalien im Wachstum und in der Entwicklung des kraniofazialen Skeletts identifiziert.5 Klotho (KL) ist ein Typ-I-Transmembranprotein, das ein wesentlicher Bestandteil von FGF-Rezeptor-1-Komplexen (FGFR1) ist.6 Die Hauptaufgabe von membranverankertem Klotho besteht darin, als Co-Rezeptor für den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 23 (FGF23) zu fungieren, da er die Bindungsfähigkeit von FGFR1 an FGF23 erhöht. FGF23 ist ein Hormon, das hauptsächlich von Osteozyten und Osteoblasten ausgeschüttet wird und zur Aufrechterhaltung der Mineralionenhomöostase dient.7 Klotho wird vorwiegend in der Niere, der Nebenschilddrüse und dem Plexus choroideus exprimiert.8 Neuere Studien haben Klotho-Transkripte im Knochen identifiziert, was auf eine signifikante lokale Wirkung hindeutet regulatorische Funktion von Klotho im Knochenstoffwechsel.9 Klotho-hypomorphe Mäuse haben eine geringe Knochenmasse und einen reduzierten Knochenumsatz.6 Es war jedoch schwierig zu unterscheiden, ob dieser Phänotyp auf einen zellautonomen Funktionsdefekt von Klotho im Knochen oder auf systemische Veränderungen zurückzuführen war aufgrund von Hyperphosphatämie und Hypervitaminose D. In einer anderen Studie wurde Prx1Cre zur bedingten Ablation von Klotho in mesenchymalen Stammzellen verwendet. Prx1Cre;KLfl/fl-Mäuse zeigten einen mit den Kontrollen vergleichbaren Skelettphänotyp; aber diese Mäuse konnten die FGF23-Expression im Skelett unter urämischen Bedingungen nicht steigern.10 Seit der Entdeckung von Klotho in Osteozyten9 konnten Komaba et al. zeigten, dass die Osteozyten-spezifische Klotho-Ablation zu einem bemerkenswerten Anstieg der Knochenbildung verbunden mit einer erhöhten Osteoblastenaktivität führte.11 Die Diskrepanz im Skelettphänotyp dieser Mausmodelle war möglicherweise auf eine bestimmte Rolle von Klotho in verschiedenen Populationen von Knochenzellen zurückzuführen.

Aufgrund der spezifischen embryonalen Abstammungslinien und Entwicklungsmuster stammt der größte Teil des kraniofazialen Skeletts aus Zellen des Neuralkamms und wird durch intramembranöse und endochondrale Ossifikation gebildet, während das Gliedmaßenskelett das Produkt mesodermaler Zellen der Seitenplatte ist und eine endochondrale Knochenbildung durchläuft.12 Daher Die Funktion von Klotho kann je nach Region des Skeletts variieren. Es ist bemerkenswert, dass Patienten mit genetischen Erkrankungen wie Tumorkalzinose, die mit der Missense-Mutation in Klotho einhergeht, schwere kraniofaziale Anomalien erleiden,13 was die wesentliche Rolle von Klotho bei der kraniofazialen Knochenentwicklung unterstreicht. Die regulatorische Funktion von Klotho bei der Ossifikation des maxillofazialen Knochens sowie bei der Pathogenese des Verlusts und der Reparatur von maxillofazialem Knochen ist jedoch weiterhin unbekannt.

In dieser Studie haben wir ein neuartiges Mausmodell mit einer gezielten Ablation von Klotho in Osterix+ (Osx+)-mesenchymalen Vorläuferzellen erstellt, um diese Fragen zu untersuchen. Die Inaktivierung von Klotho in Osx+-Vorläufern verursachte Skelettdeformationen, einschließlich einer verminderten Alveolarknochenbildung im Unterkiefer und einer verminderten Knochenresorption. Dies führte während der Entwicklung zu einem ungewöhnlich hohen Alveolarknochenvolumen. Darüber hinaus haben wir die regulatorischen Mechanismen entdeckt, die von mesenchymalem Vorläufer-exprimiertem Klotho verwendet werden, um die Osteoklastogenese zu beeinflussen. Wir fanden heraus, dass Klotho als Reaktion auf Alveolarknochenverlust und traumatische Verletzungen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Osteogenese während der Knochenreparatur spielt und gleichzeitig die entzündungsbedingte Knochenresorption hemmt, indem es auf die Signalübertragung des Tumornekrosefaktors und die Rankl-Expression abzielt. Darüber hinaus haben wir zum ersten Mal über das Vorhandensein von Klotho im menschlichen Alveolarknochen und sein ausgeprägtes Expressionsmuster sowohl unter gesunden als auch unter pathologischen Bedingungen berichtet.

Wir untersuchten eine mögliche Rolle von Klotho bei der Entwicklung des maxillofazialen Knochens, indem wir die Klotho-Expression in Osx-exprimierenden mesenchymalen Vorläufern bedingt aufhoben. Dies wurde durch Kreuzung von KLfl/fl-Mäusen mit OsxCre-Mäusen erreicht (ergänzende Abbildung 1a, b). OsxCre;KLfl/fl-Mäuse wurden mit der erwarteten Mendelschen Vererbungsrate geboren und hatten im Vergleich zu Kontroll-Wurfgeschwistern ein ähnliches Körpergewicht (ergänzende Abbildung 1c). Die Ca2+-, Pi- und intakten FGF23-Spiegel im Serum wurden bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen nicht verändert, was es uns ermöglichte, die gewebespezifische Funktion von Klotho zu isolieren (ergänzende Abbildung 1e). Durch die Färbung mit Alizarinrot/Alcianblau wurden keine signifikanten Veränderungen der Skelettmineralisierung im kraniofazialen Knochen neugeborener OsxCre;KLfl/fl-Mäuse festgestellt (ergänzende Abbildung 1f). 3 Wochen nach der Geburt ergab die μCT-Analyse ein vergleichbares Alveolarknochenvolumen im Furkationsbereich der ersten Molaren des Unterkiefers bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen und Kontrollen (Abb. 1a). Mutanten hatten ein leicht, aber nicht signifikant erhöhtes Knochenvolumen/Gewebevolumen (BV/TV, %, p = 0,180) und eine Abnahme der Trabekeltrennung (Tb.Sp, μm, p = 0,051) (Abb. 1b). Wir beobachteten bei diesen bedingten Knockout-Mäusen zu einem späteren Zeitpunkt ein signifikant höheres Alveolarknochenvolumen im Vergleich zu Wurfgeschwister-Kontrollen (Abb. 1c). Die quantitative μCT-Analyse ergab einen signifikant höheren BV/TV (p = 0,012) und eine höhere Trabekeldicke (Tb.Th, mm, p = 0,020) bei den Mutanten im Vergleich zu Kontroll-Wurfgeschwistern. Bei Tb.Sp (p = 0,170) wurde kein Unterschied beobachtet (Abb. 1d). Wir führten auch eine H&E-Färbung des Unterkieferknochens von 3 und 11 Wochen alten Mäusen durch. Es überrascht nicht, dass die trabekuläre Knochenmasse im Furkationsbereich bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen höher war. In der Histologie der Unterkiefermolaren wurden keine Veränderungen beobachtet (Abb. 1e, f).

Ein Klotho-Mangel an Osx+-Zellen führt zu einer Beeinträchtigung des Knochenumbaus. a, c Dreidimensionale Rekonstruktion aus Mikrocomputertomographie-Scans des Alveolarknochens von OsxCre;KLfl/fl-Mäusen und ihren Kontroll-Wurfgeschwistern im Alter von 3 (a) und 11 Wochen (c). b, d Quantitative Analysen des Knochenvolumens/Gewebevolumens (BV/TV, %), der Trabekeldicke (Tb.Th, μm) und der Trabekeltrennung (Tb.Sp, μm) in 3- (b, n = 5 in OsxCre Gruppe und n = 8 in der OsxCre;KLfl/fl-Gruppe) und 11 Wochen alte Mäuse (d, n = 3). e, f Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) des Alveolarknochens an der Wurzelgabelung des ersten Unterkiefermolaren bei 3 (e) und 11 Wochen alten Mäusen (f). Höhere Vergrößerungen der eingerahmten Bereiche zeigen eine erhöhte Alveolarknochenmasse bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. n = 5. g, h Calcein-Doppelmarkierung von Alveolarknochen von Kontroll- und OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. Repräsentatives Bild (g) und quantitative Analysen der Knochenbildungsrate/Knochenoberfläche (BFR/BS, μm3/μm2/Tag), der Mineralappositionsrate (MAR, μm/Tag) und der mineralisierenden Oberfläche/Knochenoberfläche (MS/BS, %) (H). n = 8. i Doppelte Fluoreszenzfärbung von RUNX2 und OSX:GFP. Höhere Vergrößerungen der eingerahmten Bereiche zeigen die RUNX2- und OSX:GFP-positive Zellverteilung an der Wurzelgabelung des 1. Molaren. j, k Quantifizierung von RUNX2- oder OSX:GFP-positiven Zellen/Gesamtosteoblasten in 3- (j) und 11 Wochen alten Mäusen (k). n = 6 in der OsxCre-Gruppe und n = 4 in der OsxCre;KLfl/fl-Gruppe. l TRAP-Färbung. Höhere Vergrößerungen der eingerahmten Bereiche zeigen, dass die Anzahl der TRAP-positiven Zellen in OsxCre;KLfl/fl-Mäusen abnahm. m Quantifizierung TRAP-positiver Zellen/Knochenoberfläche bei 3- (links) und 11 Wochen alten Mäusen (rechts). n = 4 in der OsxCre-Gruppe und n = 5 in der OsxCre;KLfl/fl-Gruppe. n qRT-PCR-Analyse der Acp5-, Mmp9-, Rankl-, Opg- und Rankl/Opg-Transkription in 11 Wochen alten Mäusen. n = 4 in der OsxCre-Gruppe und n = 6 in der OsxCre;KLfl/fl-Gruppe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken, 1 mm (a, c), 200 μm (e), 50 μm (g, i) und 100 μm (l)

Das erhöhte Alveolarknochenvolumen bei den Klotho-ablatierten Mäusen könnte auf ein Ungleichgewicht zwischen Knochenbildung und -resorption zurückzuführen sein. Daher führten wir eine dynamische Histomorphometrie am Alveolarknochen durch. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mineraloberfläche/Knochenoberfläche (MS/BS), die Mineralappositionsrate (MAR) und die Knochenbildungsrate/Knochenoberfläche (BFR/BS) bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen deutlich herunterreguliert waren (Abb. 1g, h). Als nächstes bestimmten wir die Aktivitäten von Zellen der Osteoblastenlinie durch Immunfluoreszenzfärbung. Während die Anzahl der Runt-bezogenen Transkriptionsfaktor 2 (Runx2)-positiven Zellen in mutierten Mäusen unverändert blieb, verringerte die Klotho-Deletion die Osx-Immunreaktivität signifikant (Abb. 1i-k). Im Allgemeinen definiert Runx2 die Vorläuferzellen, die für Präosteoblasten bestimmt sind, während die Osx-Expression die Differenzierung zu einem Osteoblasten bedeutet.14 Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Klotho-Ablation hauptsächlich die Osteoblastenaktivität und -reifung beeinflusst.

Die Färbung mit tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP) ergab eine signifikant verringerte TRAP-positive Osteoklasten-/Knochenoberfläche im Alveolarknochen von OsxCre;KLfl/fl-Mäusen im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrollen (Abb. 1l, m). Darüber hinaus wurden Gene, die mit der Differenzierung und Aktivierung von Osteoklasten zusammenhängen, wie Acp5 (Trap) und Matrix-Metalloproteinase 9 (Mmp9), in Mutanten deutlich unterdrückt. Als nächstes untersuchten wir die Schlüsselfaktoren, die von Osteoblasten zur Vermittlung der Knochenresorption abgesondert werden, und fanden einen verringerten Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κ-B-Liganden (Rankl), eine erhöhte Osteoprotegerin (Opg)-Expression und ein niedrigeres Rankl/Opg-Verhältnis im Alveolarknochen, was auf ein Klotho-Mesenchym schließen lässt Vorläufer-abhängiger Effekt auf die Osteoklastogenese (Abb. 1n).

Wir haben eine zentrale Funktion von Klotho bei der Alveolarknochenentwicklung in vivo nachgewiesen und als nächstes untersucht, wie der Verlust von Klotho die Ossifikation hemmt. Wir haben Gesamt-RNA aus Mandibeln von OsxCre;KLfl/fl- und OsxCre-Mäusen isoliert und einer RNA-Sequenzierung (RNA-seq) unterzogen. Das globale Transkriptom war zwischen Kontrollmäusen und Klotho-ablatierten Mäusen signifikant verändert. Unter den insgesamt 26.758 exprimierten Genen wurden 510 Gene hochreguliert, während 432 Gene in Klotho-depletierten Mandibeln herunterreguliert wurden (Abb. 2a). Es wurde festgestellt, dass die entscheidenden Regulatoren, die mit der Osteogenese verbunden sind, wie saures Dentinmatrix-Phosphoprotein 1 (Dmp1), sezerniertes Phosphoprotein 1 (Spp1), Kollagen Typ I Alpha 2 (Col1α2) und Osteomodulin (Omd), in den Mutanten signifikant unterdrückt sind ( Abb. 2b). Dementsprechend zeigte die Analyse der Genontologie (GO), dass Gene, die durch Klotho-Mangel herunterreguliert wurden, während der Entwicklung des Skelettsystems, der Ossifikation, der Entwicklung von biomineralischem Gewebe usw. stark exprimiert wurden (Abb. 2c).

Klotho begünstigt die Entwicklung des Skelettsystems, indem er die osteogene Differenzierung fördert. ein Venn-Diagramm, das 510 Gene eindeutig hochreguliert zeigt, während 432 Gene in Klotho-ablatierten Unterkiefern herunterreguliert wurden (p-Wert < 0,05). n = 3. b Heatmap repräsentativer Gene, die mit Osteogenese assoziiert sind. Rot zeigt eine hochregulierte Expression an; Blau zeigt eine herunterregulierte Expression an. c Genontologie (GO)-Anreicherungsanalyse herunterregulierter Gene in insgesamt differentiell exprimierten Genen (DEGs). d Färbung mit alkalischer Phosphatase (ALP) bzw. Alizarinrot-Färbung (ARS) nach 7 Tagen (7d) und 14 Tagen osteogener Induktion in primären Calvarial-Osteoblasten von OsxCre- und OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. n = 3. e Transkription von Osx, Runx2, Alp, Dmp1, Col1α1 und Rankl nach 14-tägiger Induktion. n = 3. f ALP-Färbung und ARS nach transfizierten Lentivirus-Partikeln zur Überexpression von Klotho (OE) oder leerer Ladung (NC). n = 3, g Transkription von Genen nach 14 Tagen Induktion. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt

Wir haben unsere Untersuchung der Rolle von Klotho aus Osx+-Vorläufern bei der Vermittlung der Osteogenese in vitro fortgesetzt. Osteoblasten von OsxCre- und OsxCre;KLfl/fl-Mäusen wurden kultiviert. Nach 7 und 14 Tagen Kultur unter osteogenen Bedingungen wiesen Klotho-deletierte Osteoblasten eine deutlich verringerte Intensität der alkalischen Phosphatase (ALP) und der Alizarinrot-Färbung (ARS) auf, begleitet von herunterregulierten osteogenen Markern, einschließlich Osx, Runx2 und alkalischer Phosphatase (Alp). , Dmp1 und Kollagen Typ I Alpha 1 (Col1α1), was auf eine verminderte osteogene Differenzierung hinweist (Abb. 2d, e). Im Gegensatz dazu wurden Osteoblasten von KLfl/fl mit Lentiviral transfiziert, um Klotho zu überexprimieren, und unter osteogenen Medien kultiviert. Die Überexpression von Klotho führt zu deutlich erhöhten ALP- und ARS-Intensitäten, begleitet von höheren Expressionsniveaus osteogenesebezogener Marker (Abb. 2f, g). Diese Daten deuten darauf hin, dass Klotho die Entwicklung des kraniofazialen Skeletts durch die Beschleunigung der osteogenen Differenzierung von Osx+-Zellen fördert.

Die obigen Daten zeigen, dass Klotho in Osteoblasten für die Bildung des Alveolarknochens im Unterkiefer wichtig ist. Wir haben daher festgestellt, ob die Deletion von Klotho den pathologischen Knochenverlust in vivo beeinflussen würde. Wir haben zunächst ein Standardmodell für apikale Parodontitis (AP) erstellt. Zu diesem Zweck wurde die Zahnpulpa der ersten Molaren des Unterkiefers bei OsxCre;KLfl/fl- und Kontrollmäusen der oralen Mikroumgebung ausgesetzt. Die μCT ergab, dass 3 Wochen nach der Modellinduktion sowohl bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen als auch bei Kontrollmäusen ein signifikanter Alveolarknochenverlust im ersten Molaren des Unterkiefers festgestellt wurde. Überraschenderweise zeigten OsxCre;KLfl/fl AP-Mäuse im Vergleich zur Kontroll-AP-Gruppe einen tieferen strahlendurchlässigen Bereich, der durch eine deutlich größere periapikale Läsionsfläche und einen deutlich größeren Trabekelmusterfaktor (Tb.Pf, 1/μm) sowie eine verkürzte Zahnwurzel gekennzeichnet war (Abb .3a, b, ergänzende Abb. 2a, b). Die histologische Untersuchung ergab, dass sowohl OsxCre;KLfl/fl- als auch Kontrollmäuse unter normalen Bedingungen erhaltene periapikale Strukturen aufwiesen. AP führte zur Infiltration von Entzündungszellen rund um die Spitze der betroffenen Zähne, begleitet von einer erhöhten Alveolarknochenresorption (Abb. 3c). Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass AP im Vergleich zu den Kontrollen erhöhte Expressionsniveaus von Tumornekrosefaktor-α (Tnf-α) und Interleukin-6 (Il-6) verursachte (Abb. 3d).

Klotho-Deletion fördert periapikale Läsionen im Alveolarknochen. a μCT-Bilder des ersten Molaren des Unterkiefers von OsxCre;KLfl/fl- und Kontrollmäusen in apikaler Parodontitis- und Schein-Gruppen. Der rote Pfeil zeigt die periapikale Läsion. b Quantitative Analyse der periapikalen Läsionsfläche einschließlich periapikaler Fläche (mm3) und periapikalem Durchmesser (μm), n = 5; und spongiöse Knochenparameter einschließlich BV/TV (%), Tb.Th (μm), Trabecular Pattern Factor (Tb.Pf, 1/μm) und Tb.Sp (μm), n = 6 in der OsxCre Sham- und AP-Gruppe, n = 7 in der OsxCre;KLfl/fl Sham-Gruppe und n = 8 in der OsxCre;KLfl/fl AP-Gruppe. c Die H&E-Färbung der Mandibeln zeigt die periapikale Läsion, die durch apikale Parodontitis verursacht wird. Die gestrichelte Linie zeigt den Bereich der periapikalen Läsion. n = 5. d Transkriptionsexpression von Tnf-α und Il-6 im periapikalen Knochen. n = 5. e, f TRAP-Färbung und Quantifizierung TRAP-positiver Zellen/Knochenoberfläche. Höhere Vergrößerungen der eingerahmten Bereiche zeigen mehr TRAP-positive Zellen im Läsionsbereich von OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. n = 3, g Immunfluoreszenzfärbung für RANKL im periapikalen Bereich. Die eingerahmten Bereiche zeigen eine höhere Expression von RANKL in der OsxCre;KLfl/fl AP-Gruppe. Gelbe gestrichelte Linien zeigen die Schnittstelle der distalen Wurzel des ersten Molaren. h Genexpression von Rankl, Opg und Rankl/Opg-Verhältnis im periapikalen Knochen des ersten Unterkiefermolaren. n = 4 in der OsxCre Sham- und OsxCre;KLfl/fl AP-Gruppe, n = 5 in der OsxCre-AP-Gruppe und n = 3 in der OsxCre;KLfl/fl Sham-Gruppe. i Immunfluoreszenz-Doppelfärbung von OSX:GFP und tdTomato im periapikalen Knochen, der die distale Wurzel des ersten Unterkiefermolaren umgibt. Die eingerahmten Bereiche zeigen stärkere Vergrößerungen von OSX:GFP- und tdTomato-doppelpositiven Zellen im periapikalen Knochen. Die weiße Pfeilspitze weist auf doppelt positive Zellen hin. j Quantifizierung von OSX:GFP- und tdTomato-doppelpositiven Zellen. n = 4 in der OsxCre-sham-Gruppe, n = 13 in der OsxCre-AP-Gruppe, n = 8 in der OsxCre;KLfl/fl-sham-Gruppe und n = 12 in der OsxCre;KLfl/fl-AP-Gruppe. *, $, #p < 0,05, **, ##p < 0,01, ***, ###p < 0,001, ****, ####p < 0,0001, * zeigt AP gegenüber Schein an, $ zeigt an OsxCre Sham im Vergleich zu OsxCre;KLfl/fl Sham, # zeigt OsxCre AP im Vergleich zu OsxCre;KLfl/fl AP an. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken, 200 μm (a, c), 100 μm (e) und 50 μm (g, i)

Es ist bemerkenswert, dass Mäuse mit Klotho-Ablation eine deutlich erhöhte Osteoklastenzahl und stärker beschädigte Zahnwurzeln aufwiesen als Kontrollmäuse, was darauf hindeutet, dass die Knochenresorption bei entzündlichem Knochenverlust in Abwesenheit von Klotho erhöht ist (Abb. 3e, f). Es ist auch erwähnenswert, dass AP-Läsionen eine erhöhte Rankl-Expression für die Differenzierung von Osteoklasten aufweisen.15 Tatsächlich hatten OsxCre;KLfl/fl-Mäuse an der AP-Läsionsstelle im Vergleich zu Kontrollmäusen eine erhöhte Rankl-Expression, was auf der Transkriptionsebene konsistent war (Abb. 3g, h). Unterdessen war die Opg-Expression bei einer Entzündung verringert, was bei Klotho-ablatierten Mäusen mit AP zum höchsten Rankl/Opg-Verhältnis führte (Abb. 3h). Der Knochenverlust ist in den meisten Fällen von AP aufgrund eines neu hergestellten Gleichgewichts zwischen Knochenresorption und Knochenbildung selbstlimitierend.16 Daher untersuchten wir als Nächstes, ob ein Klotho-Mangel diesen schützenden Regulierungsprozess während AP beeinträchtigen würde. Wir haben Kontroll- und Mutantenmäuse erzeugt, die das tdTomato-Gen exprimieren, um Zellen der Osx+-Linie während des Fortschreitens des infektionsbedingten periapikalen Knochenverlusts sichtbar zu machen. Osx-exprimierende Zellen und ihre Nachkommen, die durch OsxCre-induzierte tdTomato-Expression beurteilt wurden, wurden reichlich in der Zahnpulpa, im Parodontalband sowie in Osteoblasten und Osteozyten im Alveolarknochen nachgewiesen (Abb. 3i). Die immunfluoreszierende Doppelmarkierung von tdTomato und GFP zeigte, dass AP die Bildung von Osx:GFP+-Zellen, die ebenfalls tdTomato+ waren, signifikant induzierte (Abb. 3j). Dies legt nahe, dass die pathologische apikale Mikroumgebung die Fähigkeit zur Bildung von Hartgewebe bis zu einem gewissen Grad bewahrt, indem sie die osteogene Differenzierung erhöht. Noch wichtiger ist, dass in den Mutanten eine signifikante Verringerung der doppelt positiven Osx:GFP/tdTomato-Zellen festgestellt wurde, was auf ein beeinträchtigtes osteogenes Potenzial von Zellen schließen lässt, denen Klotho fehlt.

Wir haben die Funktion von Klotho bei der Alveolarknochenreparatur weiter untersucht, indem wir ein Alveolarhöhlenheilungsmodell erstellt haben. Die volumetrische 3D-μCT-Rekonstruktion ergab, dass die Knochenheilung an der Extraktionsstelle bei Kontrollmäusen 21 Tage nach der Zahnextraktion abgeschlossen war. Mutanten hatten jedoch eine weniger organisierte Knochenoberfläche und eine verzögerte Heilung der Alveolarpfanne (Abb. 4a). Anschließend wurde der regenerierte Knochen, der die Heilungsstelle einnahm, beurteilt. Es gab eine signifikante Abnahme des BV/TV und der Knochenmineraldichte (BMD) im neu gebildeten Knochen von OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. Es wurden keine Unterschiede bei Knochenoberfläche/Knochenvolumen (BS/BV), Trabekelzahl (Tb. N) und Tb. beobachtet. Sp in Mutanten (Abb. 4b). OsxCre;KLfl/fl-Mäuse hatten weniger miteinander verbundenen Alveolarknochen in der Extraktionshöhle, begleitet von einer größeren Knochenmarkfläche (Abb. 4c). Der Knochenumbau nach der Zahnextraktion erfolgt durch die Koordination von Osteoblasten und Osteoklasten,17 daher zählten wir als nächstes die Osteoklasten auf der Knochenoberfläche auf. In beiden Gruppen befanden sich reichlich Osteoklasten an der Knochenoberfläche der Heilungsalveolen. Allerdings stieg die Anzahl der Osteoklasten pro Knochenumfang bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen signifikant an (Abb. 4d, e). Die immunfluoreszierende Doppelmarkierung zeigte statistisch reduzierte Runx2-positive Osteoblasten in Klotho-defizienten Zellen um den Trabekelknochen in der Gelenkpfanne. Ebenso wurden bei Klotho-defizienten Mäusen im Vergleich zu Kontrollen weniger GFP+/tdTomato+-Osteoblasten nachgewiesen (Abb. 4f, g), was darauf hindeutet, dass die Klotho-Deletion zu einer unterdrückten Differenzierung der Osteoblasten nach einer traumatischen Verletzung führte. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die langsamer heilenden Extraktionsalveolen bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen auf eine Verringerung der Osteogenese, begleitet von einer beschleunigten Knochenresorption, zurückzuführen sein könnten.

Die alveoläre Knochenreparatur ist bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen abgeschwächt. a, b μCT-Bilder und quantitative Analysen der Knochenheilung in der Zahnextraktionsalveole. Weiße Ellipsen zeigen die Extraktionsalveole im Oberkiefer an. Die blaue Pfeilspitze zeigt die verzögerte Heilung der Zahnhöhle an. n = 3 in der OsxCre-Gruppe und n = 5 in der OsxCre;KLfl/fl-Gruppe. c–e H&E- und TRAP-Färbung der Zahnextraktionsalveole von Kontroll- und OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. Höhere Vergrößerungen der eingerahmten Bereiche zeigen eine geringere Knochenreparatur und mehr TRAP-positive Zellen in der Höhle von OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. n = 3 in der OsxCre-Gruppe und n = 6 in der OsxCre;KLfl/fl-Gruppe. f RUNX2-Immunfluoreszenzfärbung und doppelte Fluoreszenzmarkierung von OSX:GFP und tdTomato zeigen reduzierte Runx2- oder OSX:GFP- und tdTomato-positive Osteoblasten in Mäusen mit Klotho-Deletion. g Quantifizierung von RUNX2-positiven Zellen oder OSX:GFP- und tdTomato-doppelt-positiven Zellen im Socket. n = 4 in der OsxCre-Gruppe und n = 7 in der OsxCre;KLfl/fl-Gruppe. *p < 0,05, **p < 0,01. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken, 500 μm (a), 200 μm (c), 100 μm (d) oder 50 μm (f)

Die für diese Studie erstellten apikalen Parodontitis- und Zahnextraktionsmodelle bestätigten die nachteilige Wirkung der Klotho-Deletion auf die Gewebereparatur, indem sie sowohl Osteoblasten- als auch Osteoklastenaktivität vermittelte. Der Mechanismus, durch den ein Klotho-Mangel an Zellen der Osteoblastenlinie die Knochenresorption vermittelt, wurde anhand von Calvaria-abgeleiteten Osteoblasten untersucht, die gemeinsam mit aus Knochenmark stammenden Osteoklasten kultiviert wurden. Klotho wurde durch Verabreichung von Adenovirus-vermitteltem Cre (Ad-CRE) an Osteoblasten aus KLfl/fl-Mäusen abgetragen (Abb. 5e). Klotho-defiziente Osteoblasten zeigten eine verringerte Fähigkeit zur Unterstützung der Osteoklastogenese, was durch die verringerte Anzahl mehrkerniger TRAP+-Zellen angezeigt wird (Abb. 5a, b). Wir führten einen Grübchenresorptionstest in einem Osteoblasten-Osteoklasten-Kokultursystem durch, um die Osteoklastenaktivität zu bestimmen. In Übereinstimmung mit den TRAP-Färbungsergebnissen wiesen Osteoklasten in der Co-Kultur mit Klotho-defizienten Osteoblastenzellen im Vergleich zu Kontrollosteoblasten eine verringerte Resorptionsaktivität auf (Abb. 5c, d). Wir haben nach Schlüsselfaktoren gesucht, die von Osteoblasten abgesondert werden, um die Aktivität von Osteoklasten zu steuern, und haben herausgefunden, dass die Rankl-Expression in Klotho-ablatierten Osteoblasten herunterreguliert war, während sie in Zellen mit Klotho-Überexpression hochreguliert war (Abb. 2e, g). Darüber hinaus wurde Rankl nach der Transfektion mit Ad-CRE in Osteoblasten von KLfl/fl-Mäusen herunterreguliert (Abb. 5f). Diese Daten zeigten, dass osteoblastisches Klotho nicht zellautonom wirkt, um die Differenzierung und Aktivität von Osteoklasten zu vermitteln.

Osteoblast-Klotho vermittelt die Osteoklastenbildung und unterdrückt die TNF-α-induzierte TNF-Rezeptor-I-Aktivierung. a–d Primäre Osteoblasten von KLfl/fl-Mäusen wurden mit Adenovirus-vermitteltem Cre (Ad-CRE) transfiziert, Ad-GFP wurde als Kontrolle verwendet. Transfizierte Osteoblasten und aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMMs), die unter TNF-α- oder Vehikelbehandlung gemeinsam kultiviert wurden. a, b TRAP-Färbung und quantitative Analysen nach 9-tägiger Induktion. n = 3. c, d Grubenresorptionstest nach 13-tägiger Induktion. n = 4. e Genexpression von Klotho in Osteoblasten von KLfl/fl-Mäusen nach Adenovirus-Transfektion. n = 6. f Transkription des Osteoklastogenese-bezogenen Gens Rankl. n = 3, g Klotho-überexprimierte MC3T3-Zellen wurden mit TNF-α (10 ng/ml, 60 min) oder Vehikel behandelt, gefolgt von ChIP für Klotho. Die DNA wurde durch qPCR quantifiziert und die Ergebnisse wurden als fache Anreicherung gegenüber Kontroll-IgG dargestellt. n = 3. h GO-Anreicherungsanalyse hochregulierter Gene in DEGs. n = 3. i Genexpression von Tnfr1 im AP-Modell von OsxCre;KLfl/fl und Kontrollmäusen. n = 6 in den Gruppen OsxCre-sham und OsxCre-AP und n = 3 in den Gruppen OsxCre;KLfl/fl-sham und OsxCre;KLfl/fl AP. j Immunzytochemie von Klotho und TNFR I in Klotho-überexprimierten Vorläufern. k Die Immunzytochemie zeigt die Verteilung von NF-κB p65 im Zytoplasma und Zellkern. l Quantifizierung der TNFR I-Expression während der TNF-α-Stimulation. n = 4 in den Gruppen NC-CTRL und OE (Klotho Overexpression)-TNF-α; n = 6 in den NC-TNF-α- und OE-CTRL-Gruppen. m Quantifizierung der nuklearen Translokalisierung von NF-κB p65. n = 3 in den Gruppen NC-Vehicel und NC-TNF-α; n = 4 in den OE-Fahrzeug- und OE-TNF-α-Gruppen. n Genexpression von Rankl in primären Osteoblasten und Klotho-deletierten Osteoblasten bei Behandlung mit TNF-α in Kombination mit R-7050 (TNFR I-Inhibitor). n = 3. o Der Koimmunpräzipitationstest wurde an Klotho-überexprimierten MC3T3-Zellen durchgeführt. Proteine wurden gesammelt und mit Klotho- oder TNFR-I-Antikörpern immunpräzipitiert. Der Western Blot wurde unter Verwendung von Klotho- oder TNFR I-Antikörpern durchgeführt, um die Wechselwirkung zwischen Klotho und TNFR I zu bestimmen. IP-Immunpräzipitation. *, $, †p < 0,05, **, ##, §§p < 0,01, ***,$$$, §§§p < 0,001, ****, ####p < 0,0001, * zeigt AP versus Schein oder Vehikel versus TNF-α an. $ gibt OsxCre Sham im Vergleich zu OsxCre;KLfl/fl Sham oder NC-Fahrzeug im Vergleich zu OE-Fahrzeug an. # steht für Ad-GFP-Vehikel im Vergleich zu Ad-CRE-Vehikel, OsxCre AP im Vergleich zu OsxCre;KLfl/fl AP oder NC-TNF-α im Vergleich zu OE-TNF-α. § zeigt TNF-α im Vergleich zu TNF-α + R-7050 an. † zeigen Ad-GFP TNF-α + R-7050 im Vergleich zu Ad-CRE TNF-α + R-7050 an. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken, 100 μm (a, c) und 50 μm (j, k)

Kiefer- und Gesichtsknochendefekte können durch verschiedene Faktoren verursacht werden, darunter Entzündungen und Traumata.2 Eines der gemeinsamen Merkmale von Entzündungen und traumabedingtem Knochenverlust ist die Aktivierung der TNF-Signalübertragung.18 Um diesen Aspekt zu untersuchen, wurde TNF-α in den Osteoblasten eingeführt – Osteoklasten-Kokultursystem, um die Auswirkung des Klotho-Mangels auf die Entzündungsreaktion und Osteoklastogenese zu untersuchen. TNF-α verstärkte die Osteoblasten-induzierte Osteoklastendifferenzierung sowohl in der Kontroll- als auch in der Mutantengruppe. Die Osteoklastogenese war in kultivierten Klotho-defizienten Osteoblasten unter normalen Bedingungen abgeschwächt, aber überraschenderweise kam es in Co-Kulturen von Klotho-ablatierten Osteoblastenzellen nach TNF-α-Verabreichung zu einem noch signifikanteren Anstieg der Osteoklastenzahl und -aktivität (Abb. 5a – d). Dies ging mit einer höheren Rankl-Expression einher, was darauf hindeutet, dass Klotho möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Unterdrückung von Rankl spielt, das durch die TNF-α-Signalübertragung in Osteoblasten und die anschließende Osteoklastenbildung während einer Entzündung induziert wird (Abb. 5f). Darüber hinaus wurde ChIP-qPCR angewendet, um festzustellen, ob Klotho die angegebene regulatorische Region von Rankl binden kann. Die Behandlung von Klotho-überexprimierten Osteoblasten mit TNF-α ergab, dass Klotho induzierbar mit dem distalen regulatorischen Element von −140 kB Rankl assoziiert ist, was darauf hindeutet, dass Klotho möglicherweise eine Kernfunktion zur Unterdrückung der Rankl-Transkription bei Entzündung aufweist (Abb. 5g).

Die GO-Analyse von Genen aus Klotho-depletierten Mandibeln zeigte, dass die hochregulierten Gene mit der Regulierung der Reaktion auf externe Reize, der Regulierung der Entzündungsreaktion und dem durch Tumornekrosefaktor vermittelten Signalweg verbunden waren (Abb. 5h). Tatsächlich wurden bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen höhere Expressionsniveaus des TNF-α-Hauptrezeptors TNF-Rezeptor I (Tnfr1) beobachtet, wobei das höchste Niveau bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen unter AP festgestellt wurde. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass Klotho die Entzündungsreaktion negativ beeinflussen könnte (Abb. 5i). Um diese Hypothese zu testen, haben wir zunächst Klotho in Osteoblasten überexprimiert und unter normalen Bedingungen eine signifikant unterdrückte TNFR I-Expression in der Zytomembran festgestellt (Abb. 5j). Die Immunfluoreszenzuntersuchung der mit TNF-α behandelten Kontrollosteoblasten ergab eine höhere TNFR I-Expression im Vergleich zu einer mit Vehikel behandelten Gruppe. Diese Hochregulierung wurde jedoch durch die Klotho-Überexpression abgeschwächt (Abb. 5l). Darüber hinaus unterdrückte die Überexpression von Klotho die durch TNF-α induzierte nukleare Translokalisierung der NF-κB p65-Untereinheit signifikant, was zu einer Verringerung der aktivierten Osteoblasten auf die Gesamtzahl der Osteoblasten im Vergleich zu Kontrollzellen führte, die ebenfalls TNF-α ausgesetzt waren (Abb. 5k, m ). R-7050 ist ein niedermolekularer TNFR-Inhibitor, der die TNFR I-Assoziation mit intrazellulären Adaptermolekülen wie TRADD und RIP blockiert.19 Insbesondere verhinderte die Verabreichung von R-7050 die TNF-α-induzierte Rankl-Expression, und dies geschah ohne die Auswirkungen der Klotho-Ablation. Dies zeigt, dass Klotho unter TNF-α-Stimulation eher TNFR I selbst als seine nachgeschalteten Moleküle beeinflusst (Abb. 5n). Um die Möglichkeit einer Wechselwirkung zwischen Klotho und TNFR I weiter zu untersuchen, wurden Koimmunpräzipitationstests durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Klotho direkt an TNFR I binden könnte, was möglicherweise den TNFR I-Signalweg stört (Abb. 5o).

Die Klotho-Expression wurde in einer Vielzahl menschlicher Gewebe identifiziert, beispielsweise in der Niere, der Plazenta, der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, der Brust, der Nebenschilddrüse, dem Herzen, dem Gefäßsystem, dem Gehirn und mehreren endokrinen Geweben.20 In jüngerer Zeit wurde die Klotho-Expression im Knochengewebe gefunden bei Mäusen11 und Klotho-Genpolymorphismen wurden mit Veränderungen der Knochendichte mit zunehmendem Alter beim Menschen in Verbindung gebracht.21 Es fehlt jedoch an einer detaillierten Charakterisierung seiner Expression im menschlichen Knochen. Wir untersuchten die Klotho-Expression im menschlichen Alveolarknochengewebe, indem wir Proben von normalen Personen und Patienten mit AP sammelten. Die Immunfärbung zeigte, dass KLOTHO unter normalen physiologischen Bedingungen in der Zellmembran und im Zytoplasma von Osteoblasten und Osteozyten im Alveolarknochen stark exprimiert wurde (Abb. 6b). Unter pathologischen Zuständen zeigte die H&E-Färbung, dass das Knochengewebe von entzündungsbedingten Zellen umgeben war, gleichzeitig mit mehr TRAP-positiven Osteoklasten um das Knochengewebe herum (Abb. 6a). Noch wichtiger ist, dass der Prozentsatz der KLOTHO-positiven Zellen bei AP deutlich erhöht war, zusammen mit einer Tendenz zu einer erhöhten Genexpression (Abb. 6b, c). Die erhöhte Klotho-Transkription wurde auch bei Mäusen mit AP und Zahnextraktion beobachtet (ergänzende Abbildung 3). Interessanterweise beobachteten wir, dass die KLOTHO-Proteinexpression bei AP-Patienten im Zellkern lokalisiert war, was auf eine mögliche Kernfunktion von Klotho unter entzündlichen Bedingungen hindeutet (Abb. 6d).

Menschlicher Alveolarknochen bei apikaler Parodontitis ist mit einem veränderten Klotho-Expressionsmuster verbunden. eine H&E- und TRAP-Färbung von gesunden Personen und AP-Patienten. b Immunfluoreszenzfärbung und Quantifizierung von KLOTHO-positiven Zellen im menschlichen Alveolarknochen. n = 8 bei gesunden Personen oder 12 bei AP-Patienten. c Genexpression von KLOTHO im Alveolarknochen gesunder Personen und AP-Patienten. n = 4 bei gesunden Personen und n = 7 bei AP-Patienten. d 3D-Bilder aus konfokaler Mikroskopie zeigen das Expressionsmuster des KLOTHO-Proteins. n = 4. e Das schematische Diagramm zeigte, dass Klotho in Osx+-mensenchymalen Vorläufern proosteogene und entzündungshemmende Wirkungen während der Knochenbildung und -reparatur im Unterkiefer ausübt. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Maßstabsbalken, 100 μm (a), 50 μm (b) und 10 μm (c)

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Klotho bei mensenchymalen Vorläufern eine Schlüsselrolle bei der Bildung und Reparatur von Alveolarknochen im Unterkiefer spielt, indem es die osteogene Differenzierung direkt fördert und die Osteoklastogenese auf nicht-zellautonome Weise reguliert. Noch wichtiger ist, dass osteoblastisches Klotho eine zentrale Funktion bei der Unterdrückung von entzündungsbedingtem Knochenverlust hat (Abb. 6e). Das ausgeprägte Expressionsmuster von Klotho im menschlichen Alveolarknochen unter normalen physiologischen und pathologischen Bedingungen eröffnet Möglichkeiten zur Modulation der Klotho-Expression in mensenchymalen Vorläufern, um die Bildung und Regeneration von Alveolarknochen zu stimulieren.

Hier haben wir ein neuartiges Mausmodell der Osx-spezifischen Deletion von Klotho erstellt, das eine zentrale Funktion von Klotho bei der Regulierung der Bildung und Reparatur von Alveolarknochen im Unterkiefer zeigt. OsxCre;KLfl/fl-Mäuse zeigten im Entwicklungs- und Erwachsenenstadium eine verminderte Alveolarknochenbildung. Darüber hinaus ergab die RNA-seq-Analyse, dass die osteogene Genexpression in mutierten Mandibeln deutlich herunterreguliert war. Dies legt nahe, dass Klotho, das in Osx-exprimierenden Zellen exprimiert wird, die Osteogenese während der Alveolarknochenbildung im Unterkiefer stimuliert. Die beeinträchtigte osteogene Differenzierung bei Mutanten ähnelt der bei Klotho-hypomorphen Mäusen beobachteten, die eine verringerte Osteoblastenzahl und Osteopenie aufweisen.22 Hikone et al. fanden bei kl/kl-Mäusen eine Veränderung des parodontalen Bandes und des Unterkieferalveolarknochens. Zu den Anomalien im Alveolarknochen gehörte eine geringere Anzahl von ALP+-Osteoblasten und TRAP+-Osteoklasten, die denen ähnelten, die bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen gefunden wurden.23 Bei kl/kl-Mäusen erschwert der stark gestörte Mineralstoffwechsel jedoch die Interpretation Inwieweit ist die Störung der Klotho-Expression in Knochenzellen auf zellautonome Weise für den Skelettphänotyp verantwortlich? Tatsächlich konnte das abnormale parodontale Gewebe des interalveolären Septums von kl/kl-Mäusen durch die Verabreichung einer Diät mit niedrigem Pi-Gehalt gerettet werden.23 In dieser Studie wurde die systemische Mineralionenhomöostase bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen nicht beeinträchtigt und dies ermöglichte uns eine Präparation die gewebespezifische Rolle von Klotho. In-vitro-Kulturen primärer Osteoblasten aus OsxCre;KLfl/fl- und OsxCre-Mäusen bestätigten außerdem, dass der Verlust von Klotho die osteogene Differenzierung unterdrückt, was auf eine zellautonome Rolle von Klotho bei der Regulierung der Alveolarknochenbildung hinweist. Darüber hinaus wird FGF23 in Osteoblasten, Osteozyten, Zementoblasten und Odontoblasten im Unterkiefer exprimiert, was in hohem Maße mit der Entwicklung von Osteoblasten und der Matrixmineralisierung korreliert.24 Die lokalen Klotho/FGF23-Signale wirken bei der Vermittlung parodontaler Gewebe und der Alveolarknochenentwicklung.23,24 In unserem aktuellen Bericht Studie war die Genexpression von Fgfr1 und Egr1 in Mandibeln und iFGF23 zwischen Mutanten und Kontroll-Wurfgeschwistern vergleichbar (ergänzende Abb. 1d, e), was darauf hindeutet, dass Klotho möglicherweise auf eine von der FGF-Signalisierung unabhängige Weise funktioniert. Darüber hinaus führt die Ablation von Klotho zu einer unterdrückten Differenzierung von Osx+-mesenchymalen Vorläuferzellen in der Reparaturreaktion. Die verringerte osteogene Differenzierung von Klotho-defizienten mensenchymalen Vorläufern schien im Widerspruch zum Phänotyp von Osteozyten-spezifischen Klotho-Deletionsmäusen zu stehen, die eine hochregulierte osteoblastische Aktivität und Knochenbildungsrate aufweisen.11 Wir nehmen an, dass dieser Unterschied in den berichteten Knochenphänotypen bei Klotho-defizienten Mäusen liegt kann auf den Unterschied in der relativen Auswirkung der Deletion von Klotho auf bestimmte Zelltypen sowie auf die unterschiedlichen Merkmale der endochondralen Knochenbildung im Vergleich zur intramembranösen Knochenbildung zurückgeführt werden. Beispielsweise entwickelt sich kraniofazialer Knochen aus wandernden kranialen Neuralleistenzellen, was sich von der Bildung langer Knochen unterscheidet.25 Mehrere Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und ihre nachgeschalteten Signalwege haben unterschiedliche Funktionen im axialen und appendikulären Skelett im Vergleich zum kraniofazialen Knochen.4 Das unterschiedliche Skelett Der bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen beobachtete Phänotyp unterstreicht die spezifische Rolle von Klotho bei der Bildung des Alveolarknochens im Unterkiefer. Das bemerkenswerteste klinische Beispiel sind Patienten mit Tumorkalzinose, einer homozygoten Missense-Mutation von Klotho, begleitet von schweren orofazialen Phänotypen, wie diffuser Osteopenie und fleckiger Sklerose in den Schädeldecken sowie verkürzten Wurzeln.13 Letzteres wurde auch bei OsxCre;KLfl/ beobachtet. fl-Mäuse unter AP, was die charakteristischen Regulierungsmechanismen von Klotho über verschiedene Skelettkomponenten hinweg hervorhebt.

Wichtig ist, dass wir festgestellt haben, dass die Klotho-Deletion in Osx+-mesenchymalen Vorläufern die Osteoklastogenese signifikant verringerte. Wir beobachteten eine signifikante Reduktion der Osteoklasten bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen, begleitet von einer unterdrückten Expression von Osteoklasten-bezogenen Markern. Dieser Phänotyp ähnelt dem von Klotho-hypomorphen Mäusen, die eine verringerte Osteoblasten- und Osteoklastenzahl und eine geringere kortikale Knochendicke aufwiesen.22,26 Darüber hinaus wurde Klotho in mesenchymalen Stammzellen langer Knochen (Prx1Cre; KLfl/fl) gelöscht in Osteozyten (Dmp1Cre;KLfl/fl) zeigten beide einen Trend zu verringerten osteoklastischen Resorptionsparametern.11,27

Das gesamte Alveolarknochenvolumen war bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen relativ erhöht. Dies war auf eine deutlich unterdrückte Osteoklastogenese zurückzuführen, die stärker war als die Verringerung der Osteogenese. Dieses Ungleichgewicht in der Knochenbildung und Knochenresorption führte letztendlich zu einem unerwartet hohen Alveolarknochenvolumen bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen. Dieser Befund steht im Einklang mit mehreren anderen Beobachtungen, die ein erhöhtes trabekuläres Knochenvolumen bei kl/kl-Mäusen zeigten, begleitet von einem geringen Umsatz.28 Es ist zu beachten, dass die Klotho-Deletion im Alter von 3 Wochen keinen signifikanten Einfluss auf das Alveolarknochenvolumen hatte, obwohl dies der Fall war eine Abnahme der Anzahl von Osteoblasten und Osteoklasten. Dies könnte auf das frühe Alter der von uns analysierten Mäuse zurückzuführen sein, da sich der Phänotyp im Laufe der Zeit entwickelte, während die Mäuse das Erwachsenenstadium erreichten.

Die normale Knochenhomöostase bei Erwachsenen beruht auf einem Gleichgewicht zwischen Osteoblasten- und Osteoklastenaktivität.29 Die Hauptaufgabe von Osteoblasten besteht darin, Knochenmatrix abzulagern, sie synthetisieren und sezernieren jedoch auch parakrine Moleküle, um die Osteoklastogenese zu koordinieren.30 Die Differenzierung und Aktivierung von Osteoklasten aus ihrem monozytischen Vorläufer wird moduliert teilweise durch ein Gleichgewicht zwischen Rankl und Opg, das von Osteoblasten abgesondert wird.31 In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen wurde eine verminderte Rankl-Expression bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen beobachtet. Die Kokultur von Osteoblasten und Osteoklasten legt nahe, dass Klotho-defiziente Osteoblasten, begleitet von einer geringeren Rankl-Expression, die Osteoklastogenese in vitro nicht stimulierten. Dies weist darauf hin, dass die bei Mutanten beobachtete verringerte Knochenresorption das direkte Ergebnis der funktionellen Deletion von Klotho in Osx+-mesenchymalen Vorläufern ist. Obwohl osteoklastenspezifisches Klotho auch die Rankl-induzierte Osteoklastogenese förderte,26 kam es bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen zu einer bedingten Ablation von Klotho bei Osx+-Vorläufern, nicht jedoch bei Osteoklasten, was darauf hindeutet, dass Klotho zumindest teilweise an der Osteoblasten-abhängigen Knochenresorption beteiligt ist. durch die Rankl-Regulation in Osteoblasten. Es wurde vermutet, dass in mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks die Bindung von RANKL an RANK die RANKL-Signalübertragung aktiviert, die die Differenzierung von Osteoblasten negativ reguliert.32 Wir schlagen vor, dass die verringerte Knochenbildung in OsxCre;KLfl/fl-Mäusen hauptsächlich durch die unterdrückte Expression anderer osteogener Zellen verursacht wird. verwandte Faktoren. Die Rankl-Expression in Osx+-Zellen in OsxCre;KLfl/fl-Mäusen ist für die Vermittlung der Osteoklastogenese essentiell.

Ein weiteres interessantes Ergebnis dieser Studie ist, dass die Knochenresorption bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen in Verbindung mit entzündungsbedingtem Knochenverlust und traumatischer Knochenverletzung aktiviert wird, obwohl die Osteoklastogenese im normalen physiologischen Zustand unterdrückt ist. Es ist bemerkenswert, dass die Osteoklastenzahl und die Rankl/Opg-Werte bei Prx1Cre;KLfl/fl-Mäusen während einer urämischen Entzündung höher waren,27 was darauf hindeutet, dass Klotho in mesenchymalen Vorläufern unter pathologischen Bedingungen Osteoklastogenese vermitteln kann. Obwohl es sich bei der apikalen Parodontitis um eine destruktive Knochenpathologie handelt und die Knochenheilung bei Zahnextraktion ein regenerativer Prozess ist, beinhalten beide eine Entzündungsregulierung.33 Bei der apikalen Parodontitis stimuliert eine chronische Entzündung die TNF-α- und NF-κB-Signalwege, was zur Differenzierung und Aktivierung von Osteoklasten führt Knochenresorption.34 Der Wundheilungsprozess bei der Zahnextraktion besteht aus Entzündungs-, Reparatur- und Umbauphasen, wobei die Entzündung der entscheidende erste Schritt zur Heilung ist.35 Sie tritt unmittelbar nach der Zahnextraktion als Reaktion auf das Trauma und bakterielle Angriffe auf.36 Eine Vielfalt Viele Zytokine wie TNF-α, Interleukin-1, Interleukin-6 und Motiv-Chemokin 2 (CCL2) werden im Entzündungsstadium stark exprimiert.18 Insbesondere das proinflammatorische Zytokin TNF-α spielt dabei eine entscheidende Rolle Knochenresorption und Knochenheilung. Es stimuliert die Osteoklastogenese, indem es die Rankl-Produktion in Stromazellen, Osteoblasten und Osteozyten des Knochenmarks steigert.37 TNF-α aktiviert die Zellsignalisierung durch Bindung an zwei Arten von Rezeptoren: TNFR I und TNFR II.38 Es wird angenommen, dass TNFR I den Großteil der biologischen Prozesse vermittelt Funktion von TNF-α und ist für die Rankl-Synthese in Zellen der Osteolinie verantwortlich.39

In dieser Studie fanden wir heraus, dass die Klotho-Ablation in Osx+-mensenchymalen Vorläuferzellen die TNFR I-Expression hochregulierte, was mit höheren endogenen Spiegeln der Tnf-α- und Il-6-Expression bei mutierten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen einherging. Die GO-Analyse bestätigte weiterhin eine Hochregulierung der Entzündungswege nach der Klotho-Ablation. Andererseits unterdrückte die Überexpression von Klotho in Osteoblasten die TNFR I-Expression sowohl auf Transkript- als auch auf Proteinebene. Noch wichtiger ist, dass Klotho durch die direkte Bindung von Klotho und TNFR I die durch die TNF-α-Verabreichung induzierte NF-κB-Kerntranslokation und die anschließende Induktion der Rankl-Expression verringerte, was auf die entzündungshemmenden Funktionen von Klotho in osteoblastischen Zellen auf zellulärer Ebene hinweist. Dies könnte die erhöhte Osteoklastogenese erklären, die bei OsxCre;KLfl/fl-Mäusen unter Bedingungen einer apikalen Parodontitis und einer traumatischen Verletzung beobachtet wurde. Die Funktion von Klotho bei Entzündungen ist für klinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung, da die komplexe mikrobielle Gemeinschaft in der Mundumgebung die Homöstase und Reparatur des Alveolarknochens beeinflussen kann.40 OsxCre wurde verwendet, um Klotho in Vorläuferzellen und damit in Osteoblasten und Osteozyten zu löschen. Ein Mangel an Klotho in dieser großen Knochenzellpopulation führte zu einem Versagen bei der Hemmung von TNFR I, was die entzündungsbedingte Rankl-Produktion beschleunigte und letztendlich zu einer hochregulierten Knochenresorption führte. TNF-α wirkt auch direkt, um die Differenzierung von Makrophagen in Richtung eines Osteoklasten-Schicksals zu erhöhen.41 Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass die Anwesenheit dieser Zellen in vivo an der Entzündungsstelle auch zur Rankl-Reaktion beiträgt. Es wäre interessant, in zukünftigen Studien festzustellen, ob der mesenchymale Vorläufer Klotho eine indirekte regulatorische Rolle in Immunzellen spielt.

Über die entzündungshemmende Funktion von Klotho wurde bereits an anderen Stellen berichtet, beispielsweise in der Niere, im Endothel, in der Bauchspeicheldrüse und im peripheren Blut.42,43 Mäuse, denen Klotho fehlt, weisen bei Tieren mit Nierenerkrankungen verstärkte Entzündungsschäden auf.44 Im Gegensatz dazu ist eine exogene Ergänzung von Klotho oder die transgene Klotho-Expression können diese entzündungsbedingten pathologischen Nierenprozesse retten.45 Darüber hinaus verringerte Klotho die Entzündungsreaktion auf Lipopolysaccharid in Monozyten.46 In Endothelzellen könnte Klotho mit dem Entzündungsprozess in Verbindung gebracht werden, indem es Adhäsionsmoleküle und die NF-κB-Expression abschwächt .43 Diese Beobachtungen werden hauptsächlich auf die Funktion der löslichen Form von Klotho zurückgeführt, die durch alternatives Spleißen oder durch Ektodomänenablösung von membrangebundenem Klotho entsteht.47 Zusammen mit unserer Studie gibt es eine wichtige Wechselwirkung zwischen Klotho und der möglicherweise durch Klotho vermittelten Entzündungsreaktion negatives Feedback zum TNFR I. Ob der membrangebundene oder der lösliche Typ des Klotho-Proteins bei diesem Effekt dominant ist, bedarf weiterer Untersuchungen.

Unser grundlegendes Verständnis des zellulären Expressionsmusters von Klotho in menschlichen Geweben ist noch weitgehend unerforscht. Frühere Studien haben sowohl zytoplasmatisches als auch membrangebundenes Klotho durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Nieren, Nebenschilddrüsen, peripherem Blut, peritonealen Monozyten, Kardiomyozyten, Dickdarmkrebsgeweben und mehreren aus menschlichem Gewebe gewonnenen Zellen nachgewiesen.48 Wir zeigen hier zum ersten Mal, das Vorhandensein sowohl der Gen- als auch der Proteinexpression von endogenem Klotho im menschlichen Knochengewebe. Seine Expression ist auf die Zellmembran und das Zytoplasma in Osteoblasten und Osteozyten beschränkt, was seinem allgemeinen Expressionsmuster entspricht. Begrenzte Studien haben die nukleare Funktion von Klotho erwähnt. Deutsch et al. fanden reichlich Klotho in der Nähe der Kernmembran in Zellen des Plexus choroideus und Purkinje-Zellen im Gehirn.49 Bemerkenswert ist, dass wir in unserer Studie beobachteten, dass Klotho möglicherweise eine Kernfunktion als Reaktion auf äußere Reize wie Entzündungen hat. Mehrere Beweislinien stützen diesen Grundsatz. Erstens war das Expressionsmuster von Klotho bei Patienten mit apikaler Parodontitis dramatisch verändert. Klotho-Protein verlagerte sich in den Zellkern, begleitet von einer höheren Transkription des Klotho-Gens sowohl beim Menschen als auch bei Mäusen bei Vorliegen der Krankheit. Die Hochregulierung der Klotho-Expression im Alveolarknochen während pathologischer Zustände könnte eine schützende Wirkung haben, indem sie die entzündungsbedingte Knochenresorption hemmt. Zweitens bestätigte der ChIP-Assay, dass Klotho durch TNF-α für eine nukleare Translokalisierung induziert und an das distale regulatorische Element von Rankl gebunden wurde. Obwohl R-7050 die Stimulation von Rankl durch TNF-α blockierte, wurde darüber hinaus in Klotho-ablatierten Osteoblasten im Vergleich zu Kontrollzellen unter TNF-α- und R-7050-Behandlung eine höhere Rankl-Expression festgestellt, was die beobachtete Kernfunktion von Klotho bei der Unterdrückung unterstreicht Rankl. Diese Daten verdeutlichten die potenzielle Rolle von Klotho, die über seine frühere regonisierte Funktion als membrangebundenes Protein hinausgeht.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die spezifische Deletion von Klotho in Osx+-mensenchymalen Vorläufern die Alveolarknochenbildung und Knochenresorption im Unterkiefer verringert, was zu einer erhöhten Alveolarknochenmasse führt. Wir fanden heraus, dass Klotho-defiziente Osteoblasten weniger Rankl exprimieren, das für die Unterdrückung der Osteoklastogenese verantwortlich ist. Darüber hinaus ist die Knochenbildung während der entzündungsbedingten Knochenreparatur bei Klotho-defizienten Osteoblasten abgeschwächt. Interessanterweise wird Klotho während des Alveolarknochenumbaus bei Mäusen und Menschen aktiviert, wo es die TNF-α-induzierte Rankl-Expression in Zellen der Osteoblastenlinie hemmt und indirekt die Osteoklastenbildung vermittelt. Diese Ergebnisse offenbaren neue physiologische und pathologische Funktionen des mesenchymalen Vorläufer-exprimierten Klotho bei der Vermittlung der Entwicklung und Reparatur von Alveolarknochen im Unterkiefer.

Alle Tierversuche wurden mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des State Key Laboratory of Oral Diseases der Sichuan-Universität genehmigt wurden. Es wurden humane periapikale chirurgische Proben entnommen, nachdem alle Patienten eine Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie und zur Verwendung ihrer biologischen Gewebe unterzeichnet hatten. Die Studie wurde von der Ethikkommission des West China Hospital of Stomatology der Sichuan-Universität geprüft und genehmigt.

Floxed Klotho- und OsxCre-Mäuse wurden zuvor beschrieben.50 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Mäuse mit einem Klotho-bedingten Knockout wurden mithilfe des Cre-LoxP-Rekombinationssystems erzeugt. KLfl/fl-Mäuse wurden mit OsxCre-Mäusen gepaart, um OsxCre;KLfl/+-Mäuse zu erzeugen. Anschließend wurden männliche OsxCre;KLfl/+-Mäuse mit weiblichen KLfl/+-Mäusen gekreuzt, um OsxCre-Mäuse (Kontrolle) und OsxCre;KLfl/fl-Mäuse (Mutante) zu erhalten.

Knochenproben aus menschlichen periapikalen Läsionen wurden während endodontischer Eingriffe zur Verwendung als apikale periapikale (AP) Gruppe entnommen. Kontrollknochenproben wurden während der Unterkieferosteotomie aus einem normalen Bereich des Alveolarknochens entnommen. Zur Gesamt-RNA-Extraktion und histologischen Untersuchung wurden Proben entnommen.

P0-Mäuse wurden gehäutet und in 95 % Ethanol fixiert. Zur Analyse von Knorpel und mineralisiertem Gewebe wurden Alizarinrot S- und Alcianblau-Färbungen durchgeführt. Mandibeln und Oberkiefer von 3 und 11 Wochen alten Mäusen wurden über Nacht in 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann vor der Verarbeitung in 70 % Ethanol bei 4 °C gelagert. Die Proben wurden mit dem μCT-Scanner (μCT50, Scanco, Schweiz) gescannt, der bei 50 kV, 200 μA, mit einer Belichtungszeit von 300 ms und einer Auflösung von 7,0 μm pro Pixel betrieben wurde. Die Bilder wurden dreidimensional rekonstruiert. Als interessierende Regionen wurden die Wurzelfurkation des ersten Molaren des Unterkiefers in normalem Alveolarknochen, 1/3 der Wurzelspitze in einem apikalen Parodontitismodell und die mesiale Wurzelhöhle des ersten Molaren des Oberkiefers in einem Zahnextraktionsmodell ausgewählt. Knochenbezogene Parameter wurden gemessen, um die Qualität des Alveolarknochens und die Läsionsfläche zu analysieren.

Fixierte Proben wurden in 20 % EDTA (pH 7,5) entkalkt, in Paraffin eingebettet und mit einem HM360-Mikrotom (Microm) in 5 μm-Schnitte geschnitten. Zur Beurteilung der Histomorphologie wurde eine Hämatoxylin- (VWR) und Eosin-Färbung (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Tartratresistente saure Phosphatase (TRAP) (Sigma) wurde zum Nachweis von Osteoklasten gemäß den Protokollen der Hersteller verwendet. Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden die Objektträger zur Antigengewinnung 20 Minuten lang Natriumcitratpuffer bei 95 °C ausgesetzt, 10 Minuten lang mit 0,5 % Triton X-100 (Beyotime) permeabilisiert und 1 Stunde lang mit 5 % BSA blockiert. Die Objektträger wurden mit Anti-Runx2 (1:200, Abcam, ab23981), Anti-GFP (1:50, Santa Cruz, sc-9996), Anti-RFP (1:50, Santa Cruz, sc-390909) und Anti inkubiert -Klotho (1:100, R&D, AF1819), Anti-Klotho (1:100, Santa Cruz, sc-515939) oder Anti-Rankl (1:100, R&D, AF462) Antikörper über Nacht bei 4 °C und a Fluoreszenzkonjugierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 oder 568 (Invitrogen, 1:1000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Kerne wurden mit DAPI (Vector) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Olympus-Mikroskop FV3000 (Olympus) aufgenommen.

Mandibeln von Kontrollmäusen und mutierten Mäusen am 21. postnatalen Tag (P21) wurden verwendet, um Gesamt-RNA zu extrahieren und mit RNA-seq zu analysieren. Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit für Illumina® (NEB, USA) erstellt und Indexcodes hinzugefügt, um die Sequenzen jeder Probe zuzuordnen. Die Bibliotheksvorbereitungen wurden auf einer Illumina Hiseq-Plattform sequenziert.

Acht Wochen alte Mäuse wurden wie zuvor beschrieben zur Erstellung von Modellen für apikale Parodontitis und Zahnextraktion verwendet. Mäuse wurden mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert. Für das apikale Parodontitis-Modell wurde der erste Molar des rechten Unterkiefers mit einem Hochgeschwindigkeitshandstück geöffnet. Die Wurzelkanäle wurden mit einer endodontischen K-Feile Nr. 10 unter einem Stereomikroskop (Leica) untersucht. Die Pulpakammer wurde 3 Wochen lang der Mundhöhle ausgesetzt. Als Kontrolle dienten die kontralateralen ersten Molaren. Das Zahnextraktionsmodell wurde anhand der ersten Molaren des rechten Oberkiefers erstellt, die mit 26-G-Spritzennadeln und einer Pinzette unter dem Stereomikroskop extrahiert wurden. Um die Blutung zu stoppen, wurde sanfter Druck ausgeübt. Die Mäuse wurden nach der Operation drei Wochen lang mit Weichfutter gefüttert und getötet.

MC3T3-Zellen, die Klotho überexprimieren, wurden in 100-mm-Schalen kultiviert und durch Ganzzell-Lyse-Assay (KeyGEN) homogenisiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem erweiterten BCA-Protein-Assay-Kit (Beyotime) gemessen. Die Immunpräzipitation wurde mit Protein A/G PLUS-Agarose-Immunpräzipitationsreagenz (Santa Cruz, sc-2003) gemäß den Richtlinien des Herstellers durchgeführt. Anschließend wurden die Proben bei 70 °C mit NuPAGE LDS-Probenpuffer und NuPAGE-Reduktionsmittel (Life Technologies) degeneriert, durch NuPAGE 4–12 % Bis-Tris SDS/PAGE unter Verwendung vorgefertigter Gele (Invitrogen) getrennt und auf Polyvinylidenfluoridmembranen (Millipore) übertragen. . Nach einstündiger Blockierung wurden die Membranen über Nacht mit Anti-KLOTHO-Antikörper (1:1000, Cosmo Bio, KM2076) oder Anti-TNFR I-Antikörper (1:1000, Abcam, ab223352) inkubiert. Ziegen-Anti-Ratten-/Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper-HRP-konjugiert (1:5000, Signalway-Antikörper, L3012 und L35027) wurden verwendet und mit einem verstärkten Chemilumineszenz-Kit (Bio-Rad Laboratories) nachgewiesen.

Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Für die statistische Analyse wurde GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc.) verwendet. Zwei-Gruppen-Vergleiche wurden durch ungepaarte zweiseitige Student-t-Tests ausgewertet, und Mehrfachvergleiche wurden durch einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) oder zweifaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test durchgeführt. P-Werte <0,05 wurden für alle Analysen als signifikant angesehen.

Erweiterte Methoden und Informationen zu Calcein-Doppelmarkierung, Serummessungen, Zellkultur, Transfektion, Immunzytochemie, RNA-Isolierung und qRT-PCR-Analysen sowie ChIP-Assay sind in den ergänzenden Materialien und Methoden beschrieben.

Die Datensätze für die aktuelle Studie sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch die NSFC-Zuschüsse 81800928, 81901040 und 82171001, das Young Elite Scientist Sponsorship Program von CAST (Nr. 2020QNRC001 und 2018QNR001), das Sichuan Science and Technology Program (Nr. 2019YJ0054) und Forschungsmittel der West China School/Hospital unterstützt of Stomatology Sichuan University (Nr. RCDWJS2021-1), State Key Laboratory of Oral Diseases Open Funding Grant SKLOD202114.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yi Fan, Chen Cui.

Staatliches Schlüssellabor für orale Erkrankungen, Nationales klinisches Forschungszentrum für orale Erkrankungen, Abteilung für Kariologie und Endodontie, Westchinesisches Krankenhaus für Stomatologie, Sichuan-Universität, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Yi Fan, Chen Cui & Ruoshi Xu

Krankenhaus für Stomatologie, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Schlüssellabor für Stomatologie der Provinz Guangdong, 510055, Guangzhou, Guangdong, China

Chen Cui und Xi Wei

Maine Medical Center Research Institute, Scarborough, ME, 04074, USA

Clifford J. Rosen

Endokrine Abteilung, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, 02215, USA

Tadatoshi Sato

Staatliches Schlüssellabor für orale Erkrankungen, Nationales klinisches Forschungszentrum für orale Erkrankungen, Abteilung für orthognathische und Kiefergelenkschirurgie, Westchinesisches Krankenhaus für Stomatologie, Sichuan-Universität, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Peiran Li & Ruiye Bi

Staatliches Schlüssellabor für orale Erkrankungen, Nationales klinisches Forschungszentrum für orale Erkrankungen, Abteilung für orale Implantologie, Westchinesisches Krankenhaus für Stomatologie, Sichuan-Universität, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Quan Yuan

Staatliches Schlüssellabor für orale Erkrankungen, Nationales klinisches Forschungszentrum für orale Erkrankungen, Abteilung für Kieferorthopädie, Westchinesisches Krankenhaus für Stomatologie, Sichuan-Universität, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Chenchen Zhou

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CZ, QY und YF konzipierten die Studie und gestalteten alle Experimente. YF, CC, CZ, QY und CJR haben das Manuskript geschrieben. YF, CC, ST, RX, PL, XW und RB führten die Experimente durch und analysierten die Daten. Alle Autoren haben den Artikel gelesen und genehmigt.

Entsprechung zu Quan Yuan oder Chenchen Zhou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Fan, Y., Cui, C., Rosen, CJ et al. Klotho übt in Osx+-mesenchymalen Vorläufern proosteogene und entzündungshemmende Wirkungen während der Bildung und Reparatur von Alveolarknochen im Unterkiefer aus. Sig Transduct Target Ther 7, 155 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00957-5

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Eingegangen: 13. Dezember 2021

Überarbeitet: 3. März 2022

Angenommen: 06. März 2022

Veröffentlicht: 11. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-022-00957-5

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