Erste Identifizierung von Tyrophagus curvipenis (Acari: Acaridae) und Pathogennachweis in Apis mellifera-Kolonien in der Republik Korea

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 9469 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Milben der Gattung Tyrophagus (Acari: Acaridae) gehören zu den am weitesten verbreiteten Milben. Die Arten dieser Gattung verursachen Schäden an gelagerten Produkten und Nutzpflanzen und stellen eine Gefahr für die menschliche Gesundheit dar. Der Einfluss von Tyrophagus spp. in der Bienenzucht bleibt unbekannt. Im Jahr 2022 wurde in der Provinz Chungcheongnam, Republik Korea, eine Studie durchgeführt, die sich auf die Identifizierung von Tyrophagus-Arten in fünf Bienenhäusern konzentrierte. Ihr spezifisches Ziel bestand darin, das Vorhandensein von Tyrophagusmilben als Reaktion auf die gemeldete hohe Sterblichkeit von Honigbienenvölkern in diesem Gebiet zu untersuchen. Die morphologische Identifizierung und phylogenetische Analyse mithilfe des mitochondrialen Gens Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1 (CO1) bestätigte zum ersten Mal das Vorhandensein der Milbenart Tyrophagus curvipenis in einem Honigbienenvolk in der Republik Korea. In der Milbe wurden zwei Krankheitserreger der Honigbiene nachgewiesen, ein viraler Erreger (Deformed Wing Virus, DWV) und ein Protozoenerreger (Trypanosoma spp.). Das Vorhandensein der beiden Krankheitserreger der Honigbiene in der Milbe legt nahe, dass diese Milbe zur Ausbreitung verwandter Honigbienenkrankheiten beitragen könnte. Der direkte Einfluss der Milbe T. curvipenis auf die Gesundheit von Honigbienen ist jedoch weiterhin unbekannt und sollte weiter untersucht werden.

Honigbienen (Apis mellifera) sind wichtige Bestäuber von Nutz- und Wildpflanzen und spielen eine unverzichtbare Rolle im menschlichen Leben, indem sie wichtige Produkte wie Honig, Gelée Royale und Propolis liefern. Allerdings kam es weltweit zu einem Verlust von Honigbienenvölkern aufgrund des Klimawandels und der Ausbreitung von Krankheitserregern1,2,3. Eine der häufigsten Todesursachen bei Honigbienen sind Milben wie Varroa spp. und Tropilaelaps spp., die sich von Honigbienen ernähren und Überträger für die Übertragung von Krankheiten bei Honigbienen sind4,5,6,7. Die vektorvermittelte Übertragung erhöht die Ausbreitung von Krankheitserregern erheblich und trägt zum Zusammenbruch des infizierten Bienenvolkes bei. Der jüngste Anstieg der Verlustrate von Honigbienenvölkern ist für Imker und Forscher zu großer Sorge geworden. In vielen Ländern lag die Rate des Völkerverlusts bei bis zu 36,5 %8, und in den Jahren 2018–2019 wurde in den Vereinigten Staaten ein Verlust von etwa 37,7 % gemeldet9. In der Republik Korea (ROK) wurde der Wert der Bestäubung durch Honigbienen auf 5,9 Milliarden US-Dollar geschätzt, was etwa 50 % des wirtschaftlichen Werts der Obst- und Gemüseproduktion entspricht10; Der Verlust von etwa 18 % der Honigbienenvölker im Land ist jedoch auf unbekannte Gründe zurückzuführen11. Daher ist es wichtig, die Faktoren zu identifizieren, die sich negativ auf die Bienenzucht im Land auswirken.

Milben der Gattung Tyrophagus sind weltweit in einer Reihe von Lebensräumen verbreitet, darunter natürliche und anthropogene sowie pflanzliche und tierische Wirte12,13,14. Mehrere Arten von Tyrophagus schädigen Nutzpflanzen wie Gewächshausgemüse und Zierblumen15,16. Tyrophagus gehört zur Überordnung Acariformes, Familie Acaridae, und umfasst etwa 35 weltweit erfasste Arten12,17. Tyrophagus curvipenis (Acari: Acaridea) wurde in einer Vielzahl tierischer Wirte in Costa Rica und Russland 18 sowie in mehreren Pflanzen in Neuseeland, Frankreich, Australien und Portugal12 nachgewiesen. Fain und Fauvel berichteten erstmals über T. curvipenis-Milben, die aus Holzkonstruktionen eines Gewächshauses in Portugal isoliert wurden, und sie19 berichteten, dass Milben gelegentlich die Blüten von Orchideen besiedeln und sich möglicherweise von deren Pollen ernähren19. Mehrere Arten von Tyrophagus (wie T. putrescentiae, T. curvipenis, T. tropicus, T. debrivorus, T. similis, T. longgior, T. mixtus, T. perniciosus, T. vanheurni und T. savasi) wurden gefunden mit Bienen verbunden20. Tyrophagus putrescentiae (Acari: Acaridae) wurde in Proben toter Honigbienen21, im Körper von Hummeln22 und in Honigbienenstöcken in Brasilien nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass die Milben beim Verzehr der Produkte kontaminierter Honigbienen möglicherweise die menschliche Gesundheit schädigen23. Keine Studie berichtet über das Vorkommen der verbleibenden neun Arten von Tyrophagus bei Honigbienen. Da diese Milben als potenzielle Träger von Krankheitserregern oder Vektoren für Krankheitserregerinfektionen fungieren, können sie den Menschen indirekt beeinträchtigen24,25,26; Daher muss die Rolle von T. curvipenis und anderen Milbenarten, die Honigbienen infizieren, weiter untersucht und bewertet werden.

Die Identifizierung von Tyrophagusmilben basiert traditionell auf der Morphologie12,14,27. Allerdings ist diese Methode aufgrund der geringen Größe der Tyrophagusmilben aufwendig, erfordert ein gutes Verständnis der morphologischen Merkmale und ist zeitaufwändig. Die molekulare Methode, die auf der mitochondrialen Gen-Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1 (CO1) und dem nuklearen ribosomalen internen transkribierten Spacer 2 (ITS2) basiert, wurde als alternatives Instrument zur Artenidentifizierung mikroskopischer Milben vorgeschlagen28.

Das Screening auf die Faktoren, die für den Verlust von Honigbienenvölkern verantwortlich sind, wurde an den toten Völkern durchgeführt, die aus den Regionen mit einem im Winter gemeldeten hohen Bienenvölkerkollaps gesammelt wurden. Hier wurden im Jahr 2022 Milben aus toten Honigbienenvölkern in der ROK entdeckt und gesammelt. Die CO1- und ITS2-Sequenzen wurden analysiert, um die Milbenarten zu identifizieren. Darüber hinaus wurden auch von der Milbe übertragene Honigbienenerreger identifiziert.

Die mikroskopische Untersuchung der Honigbienenproben ergab das Vorhandensein von T. curvipenis-Milben in ihren Körpern, mit einer Befallsrate von 100 %. Die aus der Honigbienenkolonie isolierten Milben wurden mit verschiedenen Lebensstadien der gesammelten Honigbienenproben in Verbindung gebracht, nämlich dem Ei-, Larven-, Nymphen- und Erwachsenenstadium (Abb. 1a–d). Die Gattung Tyrophagus weist bei erwachsenen Milben ein besonderes Merkmal auf, wobei ihr Idiosoma weißlich bis halbtransparent erscheint (Abb. 1d). Die Identifizierung der Milbenart T. curvipenis Fain & Fauvel (Acari: Astigmata: Acaridae) erfolgte anhand weiblicher und männlicher Merkmale. Die weiblichen Milben waren klein, blass, Idiosoma 415–451 µm (n = 2) lang und 218–225 µm breit; Cheliceren 82–86 µm; Vorderschild fast fünfeckig, Augenflecken hervortretend, 83–84 µm lang, 86–84 µm breit; supracoxaler Seta (scx, 31–36 µm) schlank, mit vier mäßigen oder kurzen Pektinationen; Grandjeans Organ ist fingerförmig, sein Basallappen ist mit zwei stachelförmigen Zähnen versehen; hysterosomale Setae c1, d1 und d2 relativ kürzer als andere; c1 (34–42 µm) etwas kürzer als d2 (35–47 µm), d1 (117–109 µm) ungefähr 3,4 × die Länge von c1 und 2,6 × die Länge von d2; Spermathekalgang schmal, Basis des Spermathekalsacks r-förmig (Abb. 2a); Coxalplatte II breit dreieckig, sich distal über die Spitze des Apodeme II hinaus erstreckend, wobei 1/3 des hinteren Randes leicht konkav ist; Tarsus I ω1 schlank, zylindrisch und an der Spitze leicht verbreitert, Tarsus II ω schlank, fast zylindrisch; Setae ω und r von Tarsus IV setiform (Ergänzende Abbildung S1).

Verschiedene Stadien von Tyrophagus curvipenis bei Honigbienen (Apis mellifera) nachgewiesen. Die Identität der Akaroidmilben wurde durch Analyse der morphologischen Merkmale unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops bestimmt. Es werden verschiedene Lebensstadien der Milbe vorgestellt: Ei (a), Larve (b), Nymphe (c) und erwachsenes Tier (d).

Morphologische Charakterisierung von Tyrophagus curvipenis. Die Identifizierung von Tyrophagusmilben basierte auf der Position von Setae ve, der Form von Setae scx. (a) Weibchen, Vergleich der Größe der Setae c1, d1 und d2 mit dem Abstand zwischen diesen Setae und den hinteren Setae und der Form der weiblichen Spermatheca, (b) Männchen, S-förmiger Aedeagus und zwei gleichmäßig verteilte Saugnäpfe auf Tarsus IV.

Das Männchen war kleiner als das Weibchen, Idiosoma 319 µm (n = 1) lang und 196 µm breit. Cheliceren 71 µm; Augenflecken, Coxalplatten I und II und Solenidia I ω1 und II ω wie beim Weibchen; Aedeagus ist S-förmig gebogen; zwei Saugnäpfe gleichmäßig auf dem Tarsus IV verteilt (Abb. 2b).

Die Familie, zu der diese Art gehört, kann anhand der unter dem Mikroskop beobachteten morphologischen Merkmale bestimmt werden. Obwohl morphologische Merkmale für die erste Identifizierung sehr nützlich sind, kann die genaue Unterscheidung der genauen Art eine Herausforderung sein. Um die Identifizierung zu bestätigen, wurden artspezifische Primerpaare entworfen, die auf das CO1-Gen und die ITS2-Genregionen von Tyrophagus-Milben abzielen. Wir haben die PCR-Reaktionsbedingungen für die Amplifikation der CO1- und ITS2-Gene erfolgreich optimiert. Die Sequenzen wurden dann durch Sequenzanalyse bestimmt. Die Amplifikation der CO1- und ITS2-Regionen aus erwachsenen Milben- und Eiproben ergab Banden mit einer erwarteten Länge von 379 bzw. 500 bp (Abb. 3a). Die Sequenzen der amplifizierten Regionen waren zwischen den adulten Proben und den Eiproben zu 100 % ähnlich. Die Suche der erhaltenen CO1-Sequenzen anhand der GenBank-Datenbank (blast.ncbi.nlm.nih.gov) ergab eine 100-prozentige Sequenzidentität mit T. curvipenis aus Costa Rica (NCBI-Zugangsnummer: KY986270) und eine 86,64-prozentige Ähnlichkeit mit T. putrescentiae (NCBI-Zugangsnummer: MH262448). Die IST2-Sequenzen von T. curvipenis sind in der NCBI-Datenbank nicht verfügbar, und die Suche der aus den Proben isolierten Sequenzen anhand der GenBank-Datenbank ergab die höchste Ähnlichkeit von 91,78 % mit T. putrescentiae in China (NCBI-Zugangsnummer: GQ205623). 1). Darüber hinaus wurde bei der ITS2-Amplifikation aus einer erwachsenen Probe eine unspezifische Bande (ca. 1,7 kb lang) beobachtet (Abb. 3b). Die unerwartete Bande wurde zur Sequenzierung extrahiert. Aufgrund des schlechten Sequenzierungsergebnisses konnte das Ergebnis jedoch nicht identifiziert werden.

Verstärkung der CO1- und ITS2-Regionen von aus Honigbienen isolierten Milben. (a) PCR-Produkt von CO1, (b) PCR-Produkt von ITS2. PCR-Produkte wurden auf 1 % Agarosegel bestätigt. Spur M ist eine 100-bp-DNA-Leiter; Spuren 1 und 2 sind PCR-Produkte der Ei- bzw. Erwachsenenproben. Spur „-“ ist eine Negativkontrolle ohne DNA-Matrize. Die Amplikongröße der Proben-DNA wird in Basenpaaren (bp) angezeigt.

Die auf den CO1-Gensequenzen basierende phylogenetische Analyse ordnete die gesammelte Milbenschwester dem T. curvipenis-Isolat AD2025 zu, das aus einem Vogelnest in Costa Rica gesammelt wurde, und beide befanden sich in derselben Gruppe mit T. curvipenis, das aus Pflanzen (Pfirsich und Chayote) in Russland und Costa isoliert wurde Rica (Abb. 4).

Phylogenetischer Nachbarbaum basierend auf Sequenzen des CO1-Gens. Für jede Sequenz werden der Artname, die NCBI-Zugangsnummern und der Ursprung der Akzession angegeben. Die in dieser Studie in Honigbienenproben identifizierte Milbe ist fett gedruckt.

Der Pathogennachweis aus 15 Honigbienenproben zeigte, dass die Bienenproben mit DWV, BQCV und Trypanosoma infiziert waren (Ergänzungstabelle S1). Um die Möglichkeit einer Infektion der Milben mit dem Krankheitserreger der Honigbiene zu ermitteln, führten wir daher einen Krankheitserregernachweis unter Verwendung der aus den Milben extrahierten Gesamtnukleinsäuren durch. In Eiern und erwachsenen Proben der Milbe wurden zwei Krankheitserreger der Honigbiene (DWV und Trypanosoma) nachgewiesen. Darüber hinaus waren die beiden Krankheitserreger in den Honigbienenproben derselben Völker vorhanden, in denen die Milben gesammelt wurden. Die Identität der Krankheitserreger wurde mittels Reverse-Transkription-Echtzeit-PCR (RT-qPCR) bestätigt, die Banden von 199 bp bzw. 276 bp für DWV und Trypanosoma ergab (Abb. 5 und 6).

Nachweis des Deformed Wing Virus (DWV) aus Honigbienen- und Milbenproben. Ein positiver DWV-Nachweis wurde in den Amplifikationskurven der RT-qPCR identifiziert (a). Die Ergebnisse wurden durch Visualisierung der erwarteten Bande (199 bp lang) auf Agarosegel (b) bestätigt. Spur M ist ein 100-bp-DNA-Marker. Spuren 1 und 2 sind Banden, die aus Ei- bzw. adulten Proben von Tyrophagus curvipenis amplifiziert wurden. Die Spuren 3 und 4 zeigen die Ergebnisse von Honigbienenproben, die aus zwei Völkern entnommen wurden. Spur „–“ ist eine Negativkontrolle ohne DNA-Matrize und Spur „+“ ist eine Positivkontrolle unter Verwendung rekombinanter DNA von DWV.

Nachweis von Trypanosoma aus Honigbienen- und Milbenproben. Der positive Nachweis von Trypanosoma in der Echtzeit-PCR (a) wurde mit der erwarteten Bande (276 bp) auf dem Elektrophorese-Agarose-Gel (b) bestätigt. Die Spuren 1 und 2 zeigen die Ergebnisse des Nachweises aus Ei- bzw. adulten Proben von T. curvipenis. Die Spuren 3 und 4 sind das Ergebnis des Trypanosoma-Nachweises anhand von Honigbienenproben, die aus zwei verschiedenen Völkern entnommen wurden. Linie „–“ ist eine Negativkontrolle ohne DNA-Matrize und Linie „+“ ist eine Positivkontrolle unter Verwendung rekombinanter Trypanosoma-DNA.

In dieser Studie wurden Tyrophagusmilben in den Kolonien von fünf Bienenhäusern in Gongju, Provinz Chungcheongnam, Republik Korea, entdeckt und identifiziert. Dies ist der erste Bericht über T. curvipenis in A. mellifera-Kolonien im Land. Die morphologische und genetische Identifizierung mithilfe des CO1-Gens ergab, dass die Milbe zur Art T. curvipenis gehört, und die phylogenetische Analyse der erhaltenen Sequenz zeigte eine enge Verwandtschaft zwischen T. curvipenis aus der Republik Korea und dem Isolat aus einem Vogelnest in Costa Rica (Abb. 4). Darüber hinaus zeigte die Artenphylogenie von Tyrophagus auf der Grundlage der Nukleotidähnlichkeit in der CO1-Genregion, dass der in dieser Studie in Honigbienen nachgewiesene T. curvipenis in derselben Gruppe lag wie der in Pflanzen wie Pfirsich und Chayote aus Russland und Costa Rica identifizierte . Das Ergebnis legt nahe, dass die in dieser Studie identifizierte Quelle von T. curvipenis eine Blume sein könnte, die von der Honigbiene zum Sammeln von Pollen und Nektar besucht wird. Vier der 35 identifizierten Arten der Gattung Tyrophagus wurden bisher in der Republik Korea gemeldet: T. putrescentiae, T. similis, T. neiswanderi und T. longior29,30,31. Der hier beschriebene Tyrophagus curvipenis ist somit eine neu erfasste Art in der ROK. Ähnlich wie andere Arten wurde T. curvipenis in Honigbienenstöcken in Neuseeland gefunden32. Es wurde berichtet, dass T. putrescentiae in Korea (Wanju-gun, Jeonnam) Bienenstöcke bewohnt und sich von Trümmern und Pollen ernährt33. Der Zusammenhang zwischen der Gesundheit von Honigbienen und dem Vorhandensein der T. curvipenis-Milbe im Bienenstock ist jedoch weiterhin unbekannt.

Die molekulare Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung von Tyrophagus-Arten eingesetzt. Das Ergebnis der molekularen Methode basierend auf der CO1-Gensequenz stimmte mit der Identifizierung anhand morphologischer Merkmale überein. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Tyrophagus-Sequenzen in der NCBI-Datenbank konnte die Artenidentifizierung der Tyrophagus-Milbe jedoch nicht mithilfe der IST2-Region bestätigt werden. Darüber hinaus verstärkte das IST2-Primerpaar eine unspezifische Bande unter Verwendung der gesamten aus erwachsenen Milben extrahierten DNA (Abb. 3b). Das CO1-Gen ist aufgrund einer größeren hinterlegten Sequenzdatenbank möglicherweise vorteilhafter für die Artidentifizierung von Tyrophagusmilben.

Der Befall von Honigbienen mit Hämolymphen ernährenden Milben wie Varroa und Tropilaelaps erhöhte den Völkerverlust während der Wintersaison und die Übertragung von Honigbienenkrankheiten4,6,7,34,35,36. Die viralen, bakteriellen und pilzlichen Krankheitserreger von Honigbienen, die von Varroa- und Tropilaelaps-Milben beherbergen und übertragen werden, wurden nachgewiesen36,37. Die in dieser Studie nachgewiesene T. curvipenis-Milbe war positiv für einen viralen Honigbienen-Erreger (DWV) und einen Protozoen-Erreger (Trypanosoma). Die Infektion mit diesen Krankheitserregern schwächt das Volk und erhöht die Wintersterblichkeit der Honigbienen38,39,40. Darüber hinaus wurden diese Krankheitserreger in den Honigbienenproben nachgewiesen, in denen die Milben gesammelt wurden, was auf eine hohe Wahrscheinlichkeit schließen lässt, dass Milben solche Krankheitserreger in den Bienenstöcken übertragen. Darüber hinaus ernähren sich Tyrophagusmilben, allgemein bekannt als Vorratsmilben, von Schimmelpilzen, die in Lebensmitteln vorkommen41,42. Die Nahrungsquellen von T. curvipenis in Honigbienenstöcken sind jedoch weiterhin unbekannt. Daher würde das Verständnis des Einflusses der T. curvipenis-Milbe auf Honigbienen dazu beitragen, geeignete Methoden zur Milbenprävention und -bekämpfung zu entwickeln. Darüber hinaus ist es notwendig, die potenziellen Auswirkungen der Milben auf Menschen, die die von befallenen Völkern gesammelten Honigbienenprodukte verzehren, zu minimieren, da einige Tyrophagusmilben bei Tieren und Menschen als Allergene identifiziert wurden43,44. Mit einer beobachteten Befallsrate von 100 % und dem Potenzial, als intermediäre Krankheitsüberträger innerhalb von Honigbienenvölkern in den fünf untersuchten Bienenhäusern zu fungieren, spielen Tyrophagusmilben möglicherweise eine wichtige Rolle bei den beobachteten Bienenvölkerverlusten. Die Ergebnisse dieser Studie können zur Entwicklung gezielter Managementstrategien beitragen, die darauf abzielen, die Auswirkungen des Tyrophagusmilbenbefalls auf die Gesundheit von Honigbienen zu minimieren und die Gesamtüberlebensraten der Bienenvölker zu verbessern. Durch das Verständnis der Bedeutung von Tyrophagusmilben als potenzielle Verursacher des Bienenvölkerrückgangs können proaktive Maßnahmen ergriffen werden, um ihre negativen Auswirkungen zu mildern und das Wohlergehen der Honigbienenpopulationen zu schützen.

Dies ist die erste Aufzeichnung von T. curvipenis-Milben in Honigbienenvölkern in der Republik Korea, und diese Studie zeigte das Vorhandensein von Honigbienen-Krankheitserregern (DWV und Trypanosoma) in Milben. Das Ergebnis legt nahe, dass die Milbe eine wichtige Rolle bei der Verbreitung der Krankheitserreger der Honigbiene spielen könnte. Ob die T. curvipenis-Milbe zum Tod von Honigbienenvölkern beitrug, wurde in dieser Studie jedoch nicht bestätigt; Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um den Einfluss dieses Feindes und biologischen Überträgers von Honigbienen-Krankheitserregern in der Imkerei zu verstehen und das potenzielle Risiko von Milben für den Menschen aufzudecken, der die von befallenen Honigbienenvölkern gesammelten Produkte verzehrt.

Im November 2022 wurden Honigbienenproben aus toten Völkern in Bienenhäusern in Gongju-si, Provinz Chungcheongnam, ROK, gesammelt. Insgesamt wurden 45 Honigbienenproben aus 15 Völkern in fünf verschiedenen Bienenhäusern zur Milbenuntersuchung gesammelt. Das Vorhandensein von Milben wurde unter einem Binokularmikroskop bestätigt. Die Milben wurden von der Körperoberfläche und den Haaren von Honigbienen gesammelt. Milben wurden mit Hoyer-Medium auf Objektträger montiert. Die Proben wurden nach Fan und Zhang12 identifiziert und vermessen. Alle hier verwendeten Maße sind in Mikrometern angegeben. Nach der Artenidentifizierung wurden die Milben zur genetischen Analyse und zum Nachweis von Krankheitserregern verwendet.

Honigbienenproben und gesammelte Milben wurden dreimal mit destilliertem UltraPure™-Wasser (Invitrogen, USA) gewaschen und zur vollständigen Nukleinsäureextraktion verwendet. Für die Nukleinsäureextraktion wurde das Maxwell RSC Virus Total Nucleic Acid Purification Kit (Promega, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die extrahierten Nukleinsäuren wurden zum Nachweis von Krankheitserregern bei Honigbienen verwendet. Die Extraktion der genomischen Milben-DNA (gDNA) erfolgte mit einem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einigen Modifikationen45. Zehn erwachsene Milben oder vier Milbeneier, die aus jeder Honigbienenkolonie gesammelt wurden, wurden gepoolt und in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben, das 200 µL ATL-Puffer und 2,381 mm große Stahlkügelchen (Hanam, ROK) enthielt. Nach 15-sekündiger Homogenisierung bei 5000 U/min wurden 20 µL Proteinase K (50 µg/ml) zugegeben und die Mischung 1 Stunde bei 56 °C inkubiert. Der Lösung wurden genau 200 µL Lysepuffer zugesetzt und die Lösung 10 Minuten lang bei 70 °C inkubiert. Als nächstes wurden 200 µL 98 %iges Ethanol zugegeben und die Mischung durch Vortexen gemischt. Die Lösung wurde auf die AIAamp-Mini-Spin-Säule übertragen und 1 Minute lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen der Spin-Säule mit dem Waschpuffer wurde die genomische DNA der Milben mit dem Elutionspuffer in ein neues Röhrchen eluiert und 2 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert. Die isolierte DNA wurde zur PCR-Amplifikation der CO1- und ITS2-Regionen verwendet.

Die Milben- und Honigbienenproben jedes Volkes wurden anhand der gesamten Nukleinsäure der Honigbienen- und Milbenproben auf das Vorhandensein von Krankheitserregern der Honigbiene getestet. Zu den Krankheitserregern der Honigbiene, die nachgewiesen werden sollten, gehörten Amerikanische Faulbrut (AFB), Europäische Faulbrut (EFB), Ascosphaera apis (ASCO), Aspergillus flavus (ASP), Nosema, Acarapis woodi (ACAR), Apocephalus borealis (PHORID) und Sacbrood-Virus (SBV). ), DWV, Black Queen Cell Virus (BQCV), Chronic Bee Paralysis Virus (CBPV), Kashmir Bee Virus (KBV), Acute Bee Paralysis Virus (ABPV), Israeli Acute Paralysis Virus (IAPV), Apis mellifera Filamentous Virus (AmFV), Kladen des Lake-Sinai-Virus (LSV1, LSV2, LSV3, LSV4), Trypanosoma, Varroa-Destruktor-Virus-1 (VDV-1; DWV-B) und rekombinantes Deformed-Wing-Virus-Varroa-Destruktor-Virus-1 (DWV-VDV-1) . Der Nachweis von Krankheitserregern wurde in Honigbienenproben unter Verwendung von RT-qPCR-Kits (LiliF ABPV/KBV/IAPV/CBPV Real-time RT-PCR Kit, LifiF SBV/KSBV/DWV/BQCV Real-time RT-PCR Kit [iNtRON Biotechnology, Inc., ROK], Pobgen Bee Pathogen Detection Kit [Postbio, ROK] und iTaq Universal SYBR Green One-Step Kit [Bio-Rad, USA]). Die zum Nachweis von Honigbienenpathogenen verwendeten Primer sind in den Ergänzungstabellen S2 und S3 aufgeführt. Die in Honigbienenproben nachgewiesenen Krankheitserreger wurden mithilfe der PCR-Kits gezielt in Milbenproben nachgewiesen.

Die CO1- und ITS2-Regionen von Milben wurden unter Verwendung der universellen Primersätze CO1-forward (5ʹ-GTTTTGGGATATCTCTCATAC-3ʹ) und CO1-reverse (5ʹ-GAGCAACAACATAATAAGTATC-3ʹ)46 amplifiziert; und ITS2-vorwärts (5ʹ-CGACTTTCGAACGCATATTGC-3ʹ) und ITS2-rückwärts (5ʹ-GCTTAAATTCAGGGGTAATCTCG-3ʹ)47. Jede Reaktionsmischung (20 µL) bestand aus 20 ng gDNA-Matrize, 1 µL jedes Primers (10 pmol), AccuPower® PCR PreMix und Master Mix (Bioneer, Korea) und ddH2O (zur Auffüllung von 20 µL). Das PCR-Thermocycler-Protokoll wurde wie folgt optimiert: 94 °C (5 Min.); 5 Zyklen von 94 °C (20 s), 52 °C (30 s) und 68 °C (30 s); gefolgt von 5 Zyklen von 94 °C (20 s), 50 °C (30 s) und 68 °C (30 s); 30 Zyklen von 94 °C (20 s), 48 °C (30 s), 68 °C (30 s); und die letzten 30 Zyklen von 94 °C (20 s), 46 °C (30 s), 68 °C (30 s); und der letzte Verlängerungsschritt bei 68 °C (5 min). Nach Bestätigung der Banden von CO1 (379 bp) und ITS2 (500 bp) mittels Agarosegelelektrophorese wurden die Banden mit einem QIAquick-Gelextraktionskit (Qiagen) extrahiert und gereinigt. Die gereinigten PCR-Produkte wurden von Cosmogenetech Co, Ltd. (ROK) sequenziert.

Identifizierte Nukleotidsequenzen aus verschiedenen Proben von Erwachsenen und Eiern wurden einer BLASTn-Suche anhand der NCBI-Nukleotiddatenbank unterzogen. Die Nukleotidsequenzen wurden mit der Software BioEdit und Cluster W abgeglichen48,49. Der auf der CO1-Sequenz basierende phylogenetische Baum wurde mithilfe der Neighbor-Joining-Methode mit 1000 Bootstrap-Replikationen50 in der MEGA7-Software51 erstellt.

Alle während der aktuellen Studie generierten oder analysierten Daten sind im Repository des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Zugangsnummer OQ121480 (ITS2) und OQ121363 (CO1) verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken den Imkern für die Bereitstellung der Probemilben. Wir danken insbesondere Dr. Heung Shik Lee, Dr. Nyen Gi Jung und Dr. Ju Haeng Hur für ihre wertvollen Kommentare zu dieser Arbeit. Wir danken auch Se Jeong Ahn vom Labor für Parasiten- und Honigbienenkrankheiten für die Hilfe bei der Milbensammlung und mikroskopischen Arbeiten. Diese Arbeit wurde von der Animal and Plant Quarantine Agency der Republik Korea unterstützt (Fördernummer M-1543081-2022-24-02).

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Thi-Thu Nguyen, Mi-Sun Yoo und A-Tai Truong.

Labor für Parasiten- und Honigbienenkrankheiten, Abteilung für bakterielle Krankheiten, Abteilung für Tier- und Pflanzengesundheitsforschung, Tier- und Pflanzenquarantänebehörde, Zentrum für die Kontrolle von Honigbienenkrankheiten, 39660, Gimcheon, Republik Korea

Thi-Thu Nguyen, Mi-Sun Yoo, A-Tai Truong, So Youn Youn, Se-Ji Lee, Dong-Ho Kim, Soon-Seek Yoon und Yun Sang Cho

Abteilung für Pflanzenschädlingsbekämpfung, Abteilung für Pflanzenquarantäne, Tier- und Pflanzenquarantänebehörde, Gimcheon, 39660, Republik Korea

Jong Ho Lee

Fakultät für Biotechnologie, Thai Nguyen University of Sciences, Thai Nguyen, Vietnam

A-Tai Truong

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Konzeption und Design, TTN und YSC. Proben sammeln und Nukleinsäure isolieren, MSY, DHK, SYY und SJL; Methodik, TTN, ATT, JHL und MSY; Führte die Experimente durch: TTN, ATT, JHL und MSY; Datenanalyse und -interpretation, TTN, ATT, MSY, SSY und YSC. Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, TTN; Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten, ATT, MSY, SSY und YSC. Alle Autoren haben die endgültige Version dieses Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yun Sang Cho.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nguyen, TT., Yoo, MS., Truong, AT. et al. Erste Identifizierung von Tyrophagus curvipenis (Acari: Acaridae) und Pathogennachweis in Apis mellifera-Kolonien in der Republik Korea. Sci Rep 13, 9469 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36695-z

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Eingegangen: 09. März 2023

Angenommen: 08. Juni 2023

Veröffentlicht: 10. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36695-z

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