Durch die gereinigte Aorta: drei

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 8632 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Medien der Aortenwand sind durch sich verändernde Schichten aus Elastin und glatten Muskelzellen (SMCs) sowie Kollagenfasern in beiden Schichten gekennzeichnet und spielen eine zentrale Rolle bei funktionellen und pathologischen Umbauten wie Bluthochdruck und Arteriosklerose. Da die Arterienfunktion eng mit der inneren Struktur der Arterienwand verknüpft ist, ist es wichtig, die Veränderung der Arterienmikrostruktur während der makroskopischen Verformung zu untersuchen, um kardiovaskuläre Pathologien zu verstehen. In der vorliegenden Studie wurde eine Gewebereinigungsmethode zur dreidimensionalen mechanischen Charakterisierung der Brustaorta von Ratten angewendet und erfolgreich Veränderungen in der Struktur jeder der drei Hauptkomponenten der Aorta unter intraluminaler Druckbeaufschlagung beobachtet, wobei die mechanische Integrität und Flexibilität des Gewebes erhalten blieb. Schichten aus elastischen Fasern und SMCs verformten sich auf der Intimalseite stärker als auf der Adventitialseite. Darüber hinaus gab es eine strukturelle Übereinstimmung im Ausrichtungswinkel zwischen SMC-Kernen und elastischen Fasern auf ihrer Intimalseite, nicht jedoch auf der Adventitialseite. Dies ist die erste Studie, bei der Veränderungen in der Mikrostruktur von drei Hauptkomponenten der Aorta durch die Aorta sichtbar gemacht und ausgewertet wurden. Die hier etablierte Methode wäre auch nützlich, um die Gewebemechanik anderer tragender Weichteile zu verstehen.

Die Aortenwand besteht aus drei Schichten: Intima, Media und Adventitia. Unter ihnen steuern die Medien hauptsächlich das mechanische Verhalten der Aorta und spielen eine zentrale Rolle bei der funktionellen sowie pathologischen Umgestaltung wie Bluthochdruck und Arteriosklerose. Die Medien bestehen hauptsächlich aus Elastin, Kollagen und glatten Gefäßmuskelzellen (SMCs), die jeweils einen unterschiedlichen Elastizitätsmodul aufweisen. Als allgemein anerkannte Werte für den Modul von Elastin, Kollagen und SMC werden nämlich etwa 0,6 MPa1, 1 GPa1 bzw. 1–100 kPa2 angegeben. Elastin und SMCs bilden unterschiedliche alternierende Schichten, elastische Lamellen (EL) und glatte Muskelschichten (SML)3 in der Media, während Kollagenfasern in beiden Schichten in der Media und der Adventitia vorhanden sind. Die elastischen Lamellen bestehen aus in Umfangsrichtung ausgerichtetem Elastin (71 % des gesamten medialen Elastins), haben kleine Fenster innerhalb der blattartigen EL-Struktur4,5,6 und weisen im unbelasteten Zustand eine wellenförmige Konformation sowohl in Umfangs- als auch in Axialrichtung auf7, 8,9. Diese strukturelle Heterogenität führte zu einem nichtlinearen, viskoelastischen mechanischen Verhalten der Aorta unter intraluminaler Druckbeaufschlagung.

Das mechanische Verhalten der Aorta wird im Allgemeinen in zwei Phasen beschrieben10: eine große Verformung in einem Niederdruckbereich und eine kleine Verformung in einem Hochdruckbereich. In der ersten Phase im Niederdruckbereich dehnt sich die Aortenwand durch Dehnung der elastischen Fasern in Umfangsrichtung und Glättung wellenförmiger Kollagenfasern radial aus, während sie in der zweiten Phase im Hochdruckbereich erfolgt, der innerhalb und oberhalb des physiologischen Blutes liegt Druck zeigt die Aortenwand eine begrenzte Ausdehnung, da steife, gerade Kollagenfasern mechanischer Belastung standhalten11. Während der Gewebeverformung werden auch SMCs hauptsächlich in Umfangsrichtung verformt12, was ein mechanischer Auslöser für die Funktion von SMCs sein könnte. Da die Arterienfunktion eng mit der inneren Struktur der Arterienwand zusammenhängt, ist es wichtig, die Veränderung der Arterienmikrostruktur während der makroskopischen Verformung zu untersuchen, um kardiovaskuläre Pathologien und daraus resultierende Veränderungen der Arterienfunktionen und -mechanik zu verstehen. Solche Informationen müssen aus Experimenten gewonnen werden, die die einzigartige dreidimensionale Arterienstruktur bewahren.

Jüngste Versuche zur dreidimensionalen Charakterisierung des mechanischen Verhaltens der Aorta unter Verwendung intakter Aortenexplantate haben gezeigt, dass der Anteil der Kollagenfasern, die gewellt blieben, selbst im Hochdruckbereich in ELs höher war als in SMLs13, was darauf hindeutet, dass SMLs während des Hochdruckbereichs stärker gedehnt werden als ELs Druckbeaufschlagung. Dies kann zu einem Gleiten zwischen den Schichten während der Umfangsverformung führen14. In der Zwischenzeit wurde in dieser Studie auch berichtet, dass die Dehnungsniveaus in ELs und SMLs auf einem ähnlichen Niveau liegen und es keine statistisch signifikanten Unterschiede in den Dehnungsniveaus zwischen den inneren und äußeren Schichten von ELs und SMLs gab. Diese Ergebnisse wurden aus der Brustaorta von Mäusen gewonnen, wahrscheinlich aufgrund einer begrenzten Durchlässigkeit des angeregten Zwei-Photonen-Lasers durch eine dickere Aortenprobe von größeren Tieren13,15. Dementsprechend besteht die Notwendigkeit, das dreidimensionale mechanische Verhalten der Aorta verschiedener Modelltiere unter intraluminaler Druckbeaufschlagung zu untersuchen, um ein umfassendes Verständnis der vaskulären Biomechanik zu erhalten, und um dies zu erreichen, muss ein geeigneter Versuchsaufbau eingerichtet werden.

Die optische Mikroskopie ist ein leistungsstarkes Instrument zur Charakterisierung des mechanischen Verhaltens biologischer Weichgewebe, einschließlich Blutgefäßen. Herkömmliche konfokale Laser-Scanning-Mikroskope und sogar Multiphotonenmikroskope haben jedoch aufgrund der hohen Lichtstreuung und Absorption biologischer Gewebe (von mehreren zehn bis zweihundert Mikrometern) und damit der dreidimensionalen Beobachtung eine Einschränkung in der Tiefe, die sie beobachten können des tiefen Inneren des Gewebes war eine Herausforderung. Um solche Schwierigkeiten zu überwinden, wurden optische Reinigungsmethoden vorgeschlagen16. Obwohl diese Techniken dabei helfen, ein ganzes Gewebeexplantat oder sogar eine Maus als Ganzes zu beobachten17, beinhaltete dies die Gewebefixierung und Entfernung spezifischer Gewebebestandteile (z. B. Lipide), was zu verfestigten Gewebeproben führte und daher für die Beobachtung nicht geeignet war Weichteilverformung unter mechanischer Belastung18,19. Kürzlich wurde über eine neuartige Reinigungsmethode berichtet, die in der Lage ist, die Lebensfähigkeit ganzer Embryonen, Organoide oder sogar kleiner Modelltiere aufrechtzuerhalten, während sie transparent werden20. Tatsächlich hat diese Methode in unserer vorherigen Studie erfolgreich Sehnengewebe entfernt21. In der vorliegenden Studie haben wir diese Reinigungsmethode bei der dreidimensionalen mechanischen Charakterisierung der Brustaorta von Ratten übernommen und erfolgreich Veränderungen in der Struktur jeder der drei Hauptkomponenten der Aorta unter intraluminaler Druckbeaufschlagung beobachtet und gleichzeitig die Aufrechterhaltung der mechanischen Integrität des Gewebes nachgewiesen und Flexibilität. Die hier etablierte Methode eignet sich zur dreidimensionalen mechanischen Charakterisierung nicht nur von Blutgefäßen großer Tiere, sondern auch anderer Arten tragender Weichteile.

Zunächst haben wir mithilfe einer Zwei-Photonen-Mikroskopie bestätigt, wie die Gewebereinigung die Sichtbarkeit der Aortenprobe verbessert. In der Aorta in einem normalen, nicht geklärten Zustand in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) konnten wir nur Bilder des äußersten EL erhalten, was der Gewebetiefe von etwa 60 µm von der Oberseite der Adventitia-Oberfläche entspricht (Abb . 1a). Im Gegensatz dazu konnten wir nach der optischen Reinigung mit 60 % Jodixanollösung (Optiprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, USA) in PBS (Klärungslösung) erfolgreich durch die Aortenwand von der Adventitia bis zur Intima beobachten, die etwa 90 µm tief von der Aortenwand entfernt lag Adventitia-Oberfläche (Abb. 1a). Beachten Sie, dass schwache Fluoreszenzsignale von SMC-Kernen in den Medien darauf zurückzuführen sind, dass diese SMCs während des Färbezeitraums wahrscheinlich noch lebensfähig waren.

(a) Die Verbesserung der Sichtbarkeit durch die Gewebereinigungsmethode. Ein kurzes Segment der Brustaorta der Ratte wurde isoliert und an der Rückenseite aufgeschnitten, und die Bauchseite wurde mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop von der Adventitia zur Intima in normalem, nicht gereinigtem Zustand in PBS (links) und dem beobachtet gleiche Probe im geklärten Zustand in der Klärlösung (rechts). Bei den präsentierten Bildern handelte es sich um Projektionsbilder in der Radial-Umfangsebene (r − θ) aus den ursprünglich in der Axial-Umfangsebene erhaltenen Bildern. Elastin-Autofluoreszenz (grün), Kollagen-SHG (blau) und Fluoreszenzsignale von glatten Muskelzellkernen (rot) wurden zusammengeführt. Balken = 50 µm. (b) Die Erhaltung der Mikrostrukturen der Brustaorta der Ratte nach der optischen Reinigung. Die Querschnittsbilder in der r − θ-Ebene wurden von einer normalen, nicht gereinigten Aorta (links) und derselben Aorta nach der Reinigung (rechts) erhalten. Balken = 50 µm. Die Gesamtbilder (oben) sind die zusammengeführten Bilder der Elastin-Autofluoreszenz (grün), des Kollagen-SHG (cyan) und der Fluoreszenzsignale von glatten Muskelzellkernen (rot). Mikrostrukturen jeder Komponente werden auch einzeln dargestellt, wobei es sich um vergrößerte Bilder eines rechteckigen Bereichs handelt, der in jedem Gesamtbild mit weißen gestrichelten Linien markiert ist. Die Pfeilspitzen weisen auf eine repräsentative Mikrostruktur in jeder Komponente hin, die sowohl in der normalen als auch in der gereinigten Aorta beobachtet wurde. Balken = 50 µm.

Wir untersuchten auch, ob die vorliegende Methode der optischen Reinigung zu strukturellen Veränderungen in der Aortenwand führte. Es war offensichtlich, dass die Mikrostrukturen aus Elastinfasern, Kollagenfasern und glatten Muskelzellen in der gereinigten Aorta gut erhalten blieben (Abb. 1b). Es wurde auch beobachtet, dass sich die wellenförmigen elastischen Lamellen relativ aufrichteten und die Kerne der glatten Muskelzellen im gereinigten Zustand im Vergleich zum nicht gereinigten Zustand schmaler und länger wurden, was möglicherweise zu einer Vergrößerung des Außendurchmessers der gereinigten Aorta führte. Die Beweise stimmten gut mit den früheren Erkenntnissen über die Konservierung biologischer Organismen und Zellen mit der gleichen Reinigungsmethode überein20 und bewiesen, dass die aktuelle Reinigungstechnik keine bemerkenswerten strukturellen Veränderungen bewirkte.

Als nächstes untersuchten wir mit einem Druck-Durchmesser-Test unter Verwendung eines in Abb. 2a gezeigten Aufbaus, ob die Gewebereinigungsmethode das mechanische Verhalten der Aorta verändert. In der Reinigungslösung wurde die Aorta während des Tests transparent (Abb. 3), und dies war eine reversible Veränderung. Die Opazität der gereinigten Aorta wurde mit 0,18 ± 0,13 (Mittelwert ± SD, N = 3) bestimmt (Analyse siehe ergänzende Abbildung S1). Es gab keine offensichtlichen Unterschiede im Verformungsverhalten zwischen normalen, nicht gereinigten Aortenproben, die in PBS getestet wurden, und gereinigten Aortenproben, die in der Klärlösung getestet wurden (Abb. 4). Über den untersuchten intraluminalen Druckbereich hinweg gab es einen allgemeinen Trend, dass der Aortendurchmesser im gereinigten Zustand relativ größer war als im Normalzustand. Allerdings war eine nichtlineare Änderung des Durchmessers unter beiden Bedingungen konsistent; Die Aorta zeigte eine geringe Verformbarkeit bei einem Druck unter 40 mmHg, eine stetige Durchmesserzunahme zwischen 40 und 80 mmHg und eine geringe Durchmesseränderung über 100 mmHg (Abb. 4). In zwei Experimenten wurde die Probe nach dem Testen in der Klärlösung wieder in PBS gegeben und bei 4 °C gelagert, und das gleiche Testprotokoll wurde am folgenden Tag wiederholt. Die Druck-Durchmesser-Beziehungen sowohl in PBS als auch in der Reinigungslösung am zweiten Tag ähnelten denen des ersten Tages (ergänzende Abbildung S2) und zeigten die Erhaltung der Gewebestruktur trotz des Gewebereinigungsprozesses.

Schematische Darstellungen des Versuchsaufbaus für (a) Druck-Durchmesser-Test und (b) dynamische Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Repräsentative Fotos von Proben der Brustaorta von Ratten, die dem Druck-Durchmesser-Test unterzogen wurden. (a) Die Probe wurde in PBS getestet und (b) dann wurde sie geklärt und in der Klärlösung getestet. Beachten Sie, dass schwarze Knoten, die zum Verschluss der Interkostalarterien dienen, auf der Rückseite (Rückseite) durch die gereinigte Aorta deutlich sichtbar waren, während sie im normalen, nicht gereinigten Zustand unsichtbar waren.

Druck-Durchmesser-Beziehungen der Brustaorta von Ratten, getestet im Normalzustand in PBS und im geklärten Zustand in der Klärlösung.

Um die Verformung der Gewebestruktur durch die Aortenwand unter Anwendung von intraluminalem Druck zu beobachten, wurde eine Aortenprobe gereinigt und einer dynamischen Multiphotonenmikroskopie unter Verwendung eines in Abb. 2b dargestellten Geräts unterzogen. Die dreidimensionale Verteilung der elastischen Fasern und SMC-Kerne in den gereinigten Aorten wurde mithilfe der Multiphotonenmikroskopie eindeutig ermittelt, wie in den Signalintensitätsprofilen gezeigt (Abb. 5, 6). Kollagenfasern waren auch über die gesamte Dicke der Aortenwand sichtbar, obwohl die Signalintensität im Vergleich zu Elastin und glatten Muskelzellkernen schwächer war. Abbildung 6 zeigt die Mikrostruktur elastischer Fasern, die Verteilung von SMC-Kernen und Kollagenfasern jeweils an ELs und SMLs. Der Peak und die Variabilität der Ausrichtungswinkelverteilung jeder Komponente über die Tiefenserienbilder hinweg wurden ebenfalls in Abb. 5 dargestellt. Elastische Fasern, SMC-Kerne und Kollagenfasern folgten alle einem ähnlichen Winkelverteilungsprofil; Die meisten dieser Komponenten waren im 90°-Winkel (Umfangsrichtung) ausgerichtet, wobei einige Schichten leicht versetzt zur Umfangsrichtung (ungefähr 30°) ausgerichtet waren. Wenn intraluminaler Druck ausgeübt wurde, wurde das Ausmaß der Streuung der Orientierungswinkelverteilung kleiner. Tatsächlich lag der Spitzenwinkel der Gesamtausrichtung sowohl bei ELs als auch bei SMLs konstant bei etwa 90° von 0 bis 130 mmHg, wobei die Variabilität mit zunehmendem Druckniveau abnahm (ergänzende Abbildung S3). Die Streuung wurde auch mit zunehmendem Druck sowohl in ELs als auch in SMLs verringert (ergänzende Abbildung S3).

Repräsentative Signalintensitätsprofile der Elastin-Autofluoreszenz, der SMC-Kernfärbung und des Kollagen-SHG (oben) sowie der Spitzenausrichtungswinkel jeder Komponente (unten), erhalten durch die gereinigte Aorta bei einem intraluminalen Druck von (a) 0 mmHg und (b) 70 mmHg. Die Signalintensität wurde auf die maximale Intensität der jeweiligen Komponente normiert. Der Peak-Ausrichtungswinkel (dargestellt mit durchgezogenen Linien unten) und die Winkelstreuung (entspricht der Standardabweichung, dargestellt als Bänder) wurden mithilfe der Richtungsfunktion in ImageJ/Fiji bestimmt. Der Nullpunkt der horizontalen Achse entsprach dem Peak im ersten EL (EL1). Vertikal gezeichnete graue gestrichelte und durchgezogene Linien zeigen die Tiefenposition der lokalen Peaks der Elastin-Autofluoreszenz bzw. der SMC-Kernfluoreszenz an. Der Spitzenwinkel bei 90° entspricht der Umfangsrichtung der Aorta.

Schichtweise Darstellung der Mikrostruktur von ELs, SMLs und Kollagenfasern sowohl in ELs als auch in SMLs, sichtbar gemacht in der gereinigten Aorta. Die Achsen r, θ und z geben die radiale, umfangsmäßige bzw. axiale Richtung an. In der Mitte sind einzelne Schnitte aus dem Tiefenstapel von EL, Kollagen und SML auf der θ − z-Ebene dargestellt, die die Mikrostruktur einzelner Schichten zeigen. Das Bild von EL und SML auf der r − θ-Ebene (links bzw. rechts) wurde durch Projizieren des Bildstapels auf der θ − z-Ebene auf die r − θ-Ebene erstellt (Summenschnitte für EL bzw. Standardabweichung für SML). .

Wir haben auch analysiert, ob die Ausrichtung der Zellkerne der glatten Muskulatur mit der Ausrichtung der elastischen Fasern in der inneren (intimalen Seite) oder der äußeren (Adventitialseite) Elastinschicht übereinstimmt (Abb. 7). Bei einem intraluminalen Druck von 40 mmHg war die Ausrichtung der SMC-Kerne fast identisch mit der Ausrichtung der elastischen Fasern in der inneren Schicht, stimmte jedoch nicht mit der Elastin-Ausrichtung in der äußeren Schicht überein (Abb. 7a). Tatsächlich war der Regressionskoeffizient in der Beziehung zwischen SML und der inneren EL signifikant höher als zwischen SML und der äußeren EL (P < 0,001). Bei 100 mmHg war der Trend ähnlich wie bei 40 mmHg (Abb. 7b). Der Bereich der Spitzenwinkel wurde sowohl bei elastischen Fasern als auch bei SMC-Kernen im Vergleich zu den Verhältnissen bei 40 mmHg kleiner. Die Ausrichtung der SMC-Kerne stimmte gut mit der Ausrichtung der elastischen Fasern im inneren EL überein, korrelierte jedoch schlecht mit der Ausrichtung der elastischen Fasern im äußeren EL. Es wurde auch bestätigt, dass der Regressionskoeffizient in der Beziehung zwischen SML und dem inneren EL signifikant höher war als der zwischen SML und dem äußeren EL (P = 0,020).

Korrelationsanalyse von EL-Peakwinkeln und SML-Peakwinkeln. Die Korrelation wurde zwischen SML und seinem inneren EL (links) und zwischen SML und seinem äußeren EL (rechts) berechnet. Die Winkel wurden bei einem Druckniveau von (a) 40 mmHg bzw. (b) 100 mmHg ermittelt. Der Spitzenwinkel bei 90° entspricht der Umfangsrichtung der Aorta. N, Anzahl der Exemplare; n, die Gesamtzahl der analysierten SML- und EL-Schichtpaare. Die statistische Analyse wurde für n durchgeführt.

Als die gereinigte Aorta unter Druck gesetzt wurde, gab es einen klaren Trend, dass sich elastische Fasern und SML in den inneren Schichten in Umfangsrichtung stärker verformten als in den äußeren Schichten (Abb. 8). Die Höhe der Umfangsdehnung des innersten EL (EL1) war bei allen untersuchten Druckniveaus deutlich größer als die des äußersten EL (EL6) (P = 0,0006 bei 40 mmHg, 0,0009 bei 70 mmHg, 0,01 bei 100 mmHg und 0,01 at). 130 mmHg). Das Dehnungsniveau von EL1 war ebenfalls deutlich größer als EL 3 bei 40 mmHg (P = 0,01) und EL5 bei 40 bzw. 70 mmHg (P = 0,004 bei 40 mmHg bzw. 0,01 bei 70 mmHg). Der innerste SML (SML1) wies bei 40 mmHg (P = 0,039) eine deutlich größere Umfangsdehnung auf als SML4 bei 40 und 70 mmHg (P = 0,007 bei 40 mmHg bzw. 0,044 bei 70 mmHg). Der SML2-Wert war mit 40 mmHg ebenfalls deutlich höher als der SML5-Wert (P = 0,023). Auch die Belastungsniveaus der inneren SMLs waren bei höheren Druckniveaus größer als die der äußeren SMLs, obwohl die Unterschiede zwischen den Schichten statistisch nicht signifikant waren.

Umfangsspannung (links) und axiale Spannung (rechts) während der Druckbeaufschlagung in jeder Schicht von (a) ELs und (b) SMLs, erhalten durch dynamische Zwei-Photonen-Mikroskopie. PD im Diagramm der EL-Umfangsdehnung gibt die Umfangsdehnung an, die einfach aus den Änderungen des scheinbaren Durchmessers während der Druck-Durchmesser-Testergebnisse berechnet wird. N, Anzahl der Exemplare. Für die in runden Klammern angegebenen Belastungsdaten wurde eine statistische Analyse durchgeführt.

Im Gegensatz dazu gab es keinen so klaren Trend bei den Dehnungsniveaus in ELs und SMLs in axialer Richtung. Sowohl in ELs als auch in SMLs waren die Dehnungsniveaus in den äußeren Schichten zwar etwas höher als in den inneren Schichten, die Größen der axialen Dehnung waren jedoch deutlich geringer als die der Umfangsdehnung. Bei keinem der untersuchten Druckniveaus gab es statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Schichten.

Die Belastung der Kollagenschicht (CL) wurde bei allen Druckniveaus in einer Probe analysiert, da dies die einzige Probe war, bei der Kollagen-SHG-Bilder eindeutig über die gesamte Dicke der Aortenwand erhalten wurden. Der Stamm wurde in Kollagenfasern in EL (CL(EL)) und in Kollagenfasern in SML (CL(SML)) getrennt analysiert, wobei die gleiche Methode wie bei der EL-Stammanalyse verwendet wurde. Es gab einen allgemeinen Trend, dass die Umfangsdehnung in den inneren Schichten größer war als die in den äußeren Schichten (ergänzende Abbildung S4), was mit den beobachteten Trends bei der Dehnung in ELs und SMLs übereinstimmte.

In der vorliegenden Studie wurde die Brustaorta der Ratte unter Beibehaltung ihrer mechanischen Nachgiebigkeit optisch bis in die Tiefe gereinigt und das dreidimensionale Gewebeverhalten unter intraluminaler Druckbeaufschlagung charakterisiert. Insbesondere wurde die mechanische Belastung in jeder Schicht der drei Aortenkomponenten, nämlich Elastin, glatte Muskelzellen und Kollagen, einzeln bestimmt, was eine deutlich größere Verformung der elastischen Lamellen auf der Intimalseite im Vergleich zur Adventitiaseite zeigte. Soweit den Autoren bekannt ist, ist dies die erste Studie, die die Veränderungen in der Mikrostruktur von drei Hauptkomponenten der Aorta als Reaktion auf Druckbeaufschlagung unter Beibehaltung ihrer zylindrischen Struktur untersucht.

In der Literatur gibt es mehrere Berichte über die Beobachtung durch die Arterienwand ohne optische Reinigung unter Verwendung eines Mausmodells22,23. Im Fall der Brustaorta der Ratte war es jedoch schwierig, ohne optische Freigabe durch die Wand zu schauen (Abb. 1a), was möglicherweise an der dickeren Wand der Ratte lag. In der vorliegenden Studie ermöglichte uns die Clearing-Methode die Beobachtung feiner Strukturen von Fasern und Zellkernen durch die Aorta, indem wir Brechungsindex-Fehlanpassungen auflösten und die Spannung aus den Bildern berechneten. Das optische Clearing ermöglicht es daher, durch die Wand dickerer Arterien hindurch zu beobachten und mikroskopische Bilder mit feinen Details zu erhalten. Die aktuelle Technik bietet die Möglichkeit, Einzelheiten des mechanischen Verhaltens von Blutgefäßen zu untersuchen, die größer als die Brustaorta der Maus sind.

Der Durchmesser der Aorta vergrößerte sich leicht, als sie in der Klärlösung inkubiert wurde (Abb. 4), was möglicherweise auf einen Effekt der Gewebedehydrierung durch die Klärlösung zurückzuführen ist. Wir konnten jedoch keine statistisch signifikante Änderung des Durchmessers der in hypertonen Salzlösungen inkubierten Aorta über einen Zeitraum von 6 Stunden bestätigen, selbst in einer Lösung mit einer Osmolalität nahe der Klärlösung (ergänzende Abbildung S5). Dementsprechend ist diese geringfügige Vergrößerung des Durchmessers möglicherweise nicht ausschließlich auf eine Dehydrierung des Gewebes zurückzuführen. Es war jedoch offensichtlich, dass die ELs leicht begradigt waren und die SMC-Kerne in der gereinigten Aorta im Vergleich zur nicht gereinigten Aorta schmaler und länger wurden (Abb. 1b). Daher können die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Iodixanol, dem gelösten Stoff der Klärlösung, die Struktur der Aorta beeinflussen und die Aorta leicht aufblähen, was jedoch keinen wesentlichen Einfluss auf unsere experimentellen Ergebnisse und Schlussfolgerungen der vorliegenden Studie hat.

Eine der wichtigen Erkenntnisse der vorliegenden Studie ist, dass die Gewebeverformbarkeit der gereinigten Aorta der der nicht gereinigten Originalaorta ähnelte; Die Aorta zeigte in beiden Zuständen eine nichtlineare Druck-Durchmesser-Beziehung (Abb. 4). Ein solches mechanisches Verhalten unter intraluminaler Druckbeaufschlagung wurde auch in einer früheren Studie berichtet, bei der dieselbe Arterie aus demselben Tiermodell24 sowie dieselben und andere Arterien bei anderen Arten25,26 verwendet wurden. Die Übereinstimmung mit anderen Studien bestätigt nicht nur die in der vorliegenden Studie gewonnenen mechanischen Daten, sondern auch die Verwendung der aktuellen optischen Clearing-Methode für dynamische Zwei-Photonen-Mikroskopie-Experimente.

In früheren Studien wurde versucht, das Verhalten der Aorta unter intraluminalem Druck mithilfe von Zwei-Photonen-Mikroskopie13,14,22,23,27 und Röntgen-Synchrotron28 zu charakterisieren. Allerdings beschränkten sich die gewonnenen Erkenntnisse auf das mechanische Verhalten ausgewählter Gewebebestandteile: Veränderungen im Orientierungswinkel von Adventitia-Kollagenfasern unter Druck 27, Veränderungen im Orientierungswinkel von medialen Kollagenfasern in ELs und SMLs sowie die Unterschiede im Grad der Aufrichtung von Kollagenfasern zwischen EL und SML13, Scherbeanspruchung zwischen EL und SML14 und Entfaltung welliger elastischer Lamellen unter Druck28. Die vorliegende Studie unterscheidet sich von diesen Studien dadurch, dass die Ausrichtung und Verformung aller drei Aortenkomponenten von der innersten bis zur äußersten elastischen Lamelle analysiert wurde. Dennoch ist zu beachten, dass die Intensität des Kollagen-SHG-Signals zwischen den Proben variierte, insbesondere die der Kollagenfasern in ELs und SMLs auf der Intimalseite (EL1–3 in der vorliegenden Studie). Der mögliche Grund dafür war die Absorption von SHG-Signalen durch Kollagenfasern in der Adventitia. Wir behielten die Adventitia an Ort und Stelle, da dies notwendig war, um die ursprüngliche Gewebestruktur der Aorta zu erhalten und das mechanische Verhalten des Gewebes in vivo in der experimentellen In-vitro-Umgebung zu reproduzieren. Es war jedoch sehr wahrscheinlich, dass die Adventitia-Kollagenfasern Kollagen-SHG-Signale absorbierten und verhinderten, dass die Signale den Detektor erreichten. Da die Elastin-Autofluoreszenz und die Fluoreszenz von Zellkernen sogar tief im Inneren der Aortenwand erfolgreich beobachtet werden konnten, wurde der Zwei-Photonen-Anregungslaserstrahl nicht von den Adventitia-Kollagenfasern absorbiert oder gestreut.

Es zeigte sich deutlich, dass die Schichten auf der Intimalseite stärker deformiert waren als auf der Adventitialseite (Abb. 8). In einer früheren Studie zur Untersuchung des Umbaus der Aortenwand zu Bluthochdruck bei Ratten wurden SMCs auf der Intimalseite im Vergleich zu denen auf der Adventitiaseite in größerem Maße hypertrophisch29. Unsere Ergebnisse, dass ELs auf der Intimalseite (insbesondere EL1) in Umfangsrichtung deutlich stärker gedehnt wurden als diejenigen auf der Adventitialseite (insbesondere EL6) und ein ähnlicher Trend, der bei SMLs beobachtet wurde, sind für die vorherigen Ergebnisse gut relevant. Die vorliegenden Erkenntnisse stützen die aktuelle Annahme, dass der Bluthochdruck in der Aorta eine große mechanische Belastung (in Umfangsrichtung) auf die SMCs auf der Intimalseite ausübt und die Zellen auf die erhöhte Belastung (und den damit verbundenen Stress) reagieren, indem sie sich strukturell anpassen Halten Sie die Umfangsspannung auf einem physiologischen Niveau.

Neben den Unterschieden zwischen den Schichten in der Dehnungsgröße wurden auch die Unterschiede zwischen den Komponenten in der Dehnungsgröße sowie Änderungen in den Ausrichtungswinkeln bewertet. Wir fanden jedoch keine statistisch signifikanten Unterschiede in den Dehnungsgrößen zwischen drei Komponenten in jeder Schicht (ergänzende Abbildung S6) oder signifikante Änderungen im Ausrichtungswinkel während des Aufblasens (ergänzende Abbildung S7). Darüber hinaus wurde versucht, die Wechselwirkungen zwischen Komponenten genau zu untersuchen, was jedoch bei der aktuellen Bildauflösung schwierig durchzuführen war. Es wird vermutet, dass wir die Mechanismen visualisieren könnten, wie SMCs in situ stimuliert werden, da die Reibungsscherstimulationen zwischen ihren Zellkörpern und benachbarten Kollagenfasern aufgrund unterschiedlicher lokaler Spannungen zwischen Kollagenfasern und SMCs auftreten können. Solche Details der mechanischen SMC-Umgebung werden ein Ziel unserer zukünftigen Arbeit sein.

Aus unseren Dehnungsdaten (Abb. 8) ging hervor, dass die aus der Durchmesseränderung im Druck-Durchmesser-Test (PD) berechnete Umfangsdehnung kleiner war als die aus der dynamischen Zwei-Photonen-Mikroskopie (EL1–EL6) berechnete. Dies folgt einer theoretischen intramuralen Verteilung der Umfangsspannung entlang der radialen Richtung in einem dickwandigen Zylinder, der einem Innendruck ausgesetzt ist. Mit anderen Worten: Da der Durchmesser der Aorta anhand der Bilder der Außenseite der Aorta gemessen wurde (Abb. 3), erfolgte die Messung der Dehnung mehr an der Außenseite als bei EL6, was zu einem kleineren Dehnungswert als bei EL6 führte. Darüber hinaus ist hervorzuheben, dass die lokale EL-Belastung auf der Bauchseite der Aorta gemessen wurde. In früheren Studien von uns30 und anderen31 war die Umfangsdehnung der Aorta als Reaktion auf intraluminale Druckbeaufschlagung auf der Bauchseite größer als auf der Rückenseite. Angesichts der Tatsache, dass die Gesamtumfangsdehnung der Aorta, die in der vorliegenden Studie der PD-Belastung entspricht, als Durchschnitt der ventralen und dorsalen Dehnungen geschätzt werden kann, war die Umfangsdehnung des Abdomens etwa 5 % größer als die Gesamtumfangsdehnung30,31. In der vorliegenden Studie war die Umfangsdehnung von EL6 7–10 % größer als die Umfangsdehnung von PD, was im Wesentlichen mit diesen früheren Ergebnissen übereinstimmte. Da die EL6-Dehnung innerhalb der Aorta gemessen wurde, während die PD-Dehnung von der radial äußersten Oberfläche der Aorta aus gemessen wurde, könnte die EL6-Dehnung größer sein als die Umfangsdehnung, die an der äußersten Oberfläche der Bauchseite der Aorta ermittelt wurde. Dieser Unterschied in der radialen Position bei der Dehnungsmessung führte möglicherweise zu unseren Ergebnissen, dass der Unterschied zwischen EL6- und PD-Dehnungen relativ größer war als die berichteten Unterschiede zwischen den ventralen und gesamten Umfangsdehnungsverhältnissen. Es gab auch einige Faktoren, die den Unterschied zwischen PD und EL6 beeinflussten, wie z. B. der Unterschied in der Dehnungsmessmethode (gemessen anhand der Faserstruktur in EL6, während gemessen anhand der Gesamtarteriengröße) und der Bildgebungsmethode (Zweiphotonenmikroskop vs. Stereomikroskop).

Ein weiteres wichtiges Ergebnis der vorliegenden Studie war die Übereinstimmung im Ausrichtungswinkel des Kerns von SMCs und darunter liegenden elastischen Fasern. Obwohl berichtet wird, dass SMCs sowohl an ihrer Innen- als auch an ihrer Außenseite an ELs verankern, könnte die Bevorzugung der Kernausrichtung auf einer Seite der ELs für den Strukturentwicklungsprozess der Aortenwand relevant sein. Es wird angenommen, dass die Aortenstruktur durch die Bildung einer röhrenförmigen Struktur durch Endothelzellen und die anschließende Umhüllung durch mesenchymale Zellen entsteht33. Während sich die Zellen zu SMCs differenzieren, wird Elastin synthetisiert und zwischen den Zellschichten abgelagert33. Da sich die (innere) Intimalseite durch den intraluminalen Druck stärker verformt als die (äußere) Adventitia-Seite, ziehen es die Zellen möglicherweise vor, auf ihrer Innenseite eine Struktur aufzubauen, die mit Fasern verstärkt ist, die in Richtung der Verformung ausgerichtet sind, um mechanischer Belastung standzuhalten. Andere Mechanismen, wie beispielsweise eine spontane Bildung der ausgerichteten Struktur elastischer Fasern, könnten möglich sein, da eine dreidimensionale laminare Struktur mit hochorganisierten Kollagenfasern in jeder Schicht nur mit Kollagenmolekülen selbst durch molekulare Verdrängung gebildet werden kann34. Bei der Entwicklung der Aorta ist dies jedoch möglicherweise nicht der Fall, da sich mesenchymale Zellen vor ihrer Elastinsynthese ansammeln und daher möglicherweise keine Zeit und/oder kein Raum für die spontane Ausrichtung elastischer Fasern vorhanden ist.

In der dynamischen Zwei-Photonen-Mikroskopie wurde der Zellkern fluoreszierend mit Ethidium homodimer-III markiert, das tote Zellkerne markiert. Dieser Farbstoff wurde aufgrund der Trennung der Wellenlänge des Emissionslichts von der Probe sowie der Anfärbbarkeit ausgewählt. Die gute Anfärbbarkeit mit dem Marker für tote Zellen weist jedoch darauf hin, dass SMCs in der gereinigten Aorta nicht lebensfähig waren. Es ist bekannt, dass der SMC-Zustand zwischen kontrahiert und entspannt das mechanische Verhalten der Muskelarterien erheblich beeinflusst, beim Verhalten elastischer Arterien wie der Halsschlagader wurden jedoch nur geringfügige Veränderungen beobachtet35. Die in der vorliegenden Studie verwendete Rattenaorta wird ebenfalls als elastische Arterie kategorisiert. Obwohl SMCs in der gereinigten Aorta nicht lebensfähig sind, wird daher davon ausgegangen, dass das mechanische Verhalten der gereinigten Aorta dem Verhalten der normalen, nicht gereinigten Aorta weitgehend entspricht.

Es wurde berichtet, dass eine Technik zur Gewebereinigung die Gewebemechanik beeinflusst36. In diesem Bericht wurde PBS, ergänzt mit 80 % Propylenglykol (PG), zur optischen Reinigung der Schweineaorta verwendet, sodass das Gewebe dehydriert wurde, um optische Transparenz zu erhalten. Diese Technik erhöhte auch die Steifheit der Aorta. Da die Gewebereinigung mit PG durch die Entfernung von lichtstreuendem Wasser aus dem Gewebe und die Destabilisierung der Kollagenstruktur höherer Ordnung durch chemische Wirkstoffe in der Reinigungslösung (z. B. PG)37 erreicht wurde, waren Veränderungen im mechanischen Verhalten unvermeidbar. In der vorliegenden Studie hingegen verwendeten wir 60 % Iodixanollösung (Optiprep) in PBS als Klärlösung, die eine geschätzte Osmolalität von 470 mOsm/L aufweist. Dies war deutlich niedriger als die geschätzte Osmolalität von 80 % PG in PBS (11.000 mOsm/L)38. Die Ergänzung von Optiprep zum Medium zielt darauf ab, eine Diskrepanz zwischen den Brechungsindizes zwischen Geweben/Zellen unter der Bildgebung und dem Medium für die Bildgebung zu reduzieren20, jedoch nicht darauf, eine Austrocknung des Gewebes herbeizuführen, um Gewebetransparenz zu erreichen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Aorta von Schweinen undurchsichtig blieb, wenn sie in 30 %iger PG-Lösung inkubiert wurde36 (geschätzt auf 4000 mOsm/L38). Daher dürfte die durch Osmolalität induzierte Dehydrierung durch unsere Reinigungslösung sehr gering sein und nicht ausreichen, um die Rattenaorta klar zu machen. In unseren Ergebnissen spiegelte sich auch wider, dass das mechanische Verhalten der gereinigten Rattenaorta dem der normalen Aorta ähnelte (Abb. 4), was möglicherweise auf einen geringen Effekt der aktuellen Reinigungsmethode auf die Gewebemechanik hindeutet. Eine Strategie zur Gewebeentwässerung kann geeignet sein, um dicke Proben wie die Aorta von Schweinen optisch zu reinigen. Daher wird es in zukünftigen Studien ein interessantes Forschungsthema sein, Methoden zur Gewebereinigung für große Aortenproben zu vergleichen.

Eine der Einschränkungen in der vorliegenden Studie besteht darin, dass wir nicht untersucht haben, ob die Gewebereinigung die mechanischen Reaktionen der Aorta beeinflusst, insbesondere auf Mikrostrukturebene. Obwohl wir bestätigt haben, dass die Gewebereinigung keine deutlichen Veränderungen in der Struktur der Aorta im unbelasteten Zustand (Abb. 1) und im makroskopischen mechanischen Verhalten (Abb. 4) hervorrief, liefern diese Ergebnisse keine Bestätigung dafür, dass es auch mikrostrukturelle Reaktionen gibt Gleiches gilt für die normale und die gereinigte Aorta. Daher sollte eine zukünftige Studie durchgeführt werden, um dieses Problem anzugehen.

Zusammenfassend haben wir ein experimentelles Modell zur Charakterisierung des mechanischen Verhaltens der Aorta anhand der Dicke des Gewebes durch optische Klärung unter Beibehaltung der Gewebecompliance erstellt. Es wurde bestätigt, dass die Größe der Umfangsspannung der elastischen Schichten stark von der Position innerhalb der Aortenwand abhängt und die Ausrichtung der glatten Muskelzellen gut mit der der elastischen Fasern auf ihrer Intimaseite übereinstimmt.

In der vorliegenden Studie wurden insgesamt 8 männliche Wistar-Ratten (8–9 Wochen alt) verwendet. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Review Board for Animal Care der Graduate School of Engineering der Universität Nagoya genehmigt (Genehmigungsnummer 18-8) und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für Tierversuche der Universität Nagoya sowie den ARRIVE-Richtlinien39 durchgeführt. Mehrere Tage vor dem Experiment wurde jeweils ein Tier gekauft und bis zur Tötung in einem Einzelkäfig gehalten. Alle Ratten wurden in einem regelmäßigen Tagesbeleuchtungszyklus (12:12 hell:dunkel) gehalten und hatten nach Belieben Zugang zu Futter (CLEA Rodent Diet CE-2) und Wasser. Um den Käfig sauber zu halten, wurde ein automatisches Spülsystem verwendet. Die Tiere wurden in einem speziell dafür vorgesehenen Tierraum untergebracht, der das ganze Jahr über belüftet und auf 25 °C gehalten wurde, und durften normale tägliche Aktivitäten ausüben. Den Ratten wurde vor der Tötung keine Analgesie verabreicht. Das Verhalten der Tiere wurde jeden Tag sorgfältig überprüft und vor der Verwendung in den Experimenten waren bei allen Tieren keine offensichtlichen Anomalien erkennbar. Die Experimente waren darauf ausgelegt, den Einsatz der Tiere auf ein Minimum zu beschränken.

Die Tiere wurden mit Kohlendioxidgas getötet und der röhrenförmige Abschnitt der Brustaorta mit einer In-vivo-Länge von etwa 40 mm wurde von jeder Ratte unmittelbar nach der Tötung entnommen. Die In-vivo-Länge zwischen der proximalen und der distalen Schnittposition wurde aufgezeichnet, um die physiologische Länge in den unten beschriebenen In-vitro-Experimenten zu reproduzieren (ein durchschnittliches Dehnungsverhältnis von 1,4). Die isolierte Aorta wurde in PBS gelegt, während lose verbundene Weichteile rund um die Aortenoberfläche, einschließlich Fett, vorsichtig entfernt wurden, während die Adventitia an Ort und Stelle blieb.

Aus einer isolierten Aorta wurde ein kurzer Längsschnitt entnommen und auf der dorsalen Seite aufgeschnitten. Die Probe wurde in 5 µM Ethidium homodimer-III (Biotium, USA) in PBS über Nacht bei 4 °C inkubiert, um die Kerne glatter Muskelzellen anzufärben, und wurde unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop (A1R MP, Nikon, Japan) in a abgebildet Nicht gelöschter, normaler Zustand innerhalb von PBS. Die rechteckige Probe wurde flach mit der Adventitia der Bauchseite nach oben gelegt. Bilder auf der Axial-Umfangsebene (z − θ) wurden von der Adventitia zur Intima mit einem 25-fachen Wasserimmersionsobjektiv und einem Anregungslaser bei einer Wellenlänge von 860 nm aufgenommen. Elastin wurde durch seine Autofluoreszenz mit einem 525/50-Filter abgebildet. Fluoreszenzsignale von glatten Muskelzellkernen wurden mit einem 575/25-Filtersatz erhalten. Kollagenfasern wurden sichtbar gemacht, indem SHG-Signale (Second Harmonic Generation) von Kollagenmolekülen mit einer Photomultiplierröhre gesammelt wurden, die mit einem 492SP-Filtersatz ausgestattet war. Eine Tiefenserie von Bildern, die jeweils aus 512 × 512 Pixeln bestand und einen quadratischen Bereich von 510 µm abdeckte, wurde mit einer Rate von 0,5 fps und einer 2-fachen Mittelung im Abstand von 1 µm aufgenommen, bis die faserige Struktur des Elastins nicht mehr erkennbar war. Anschließend wurde die Probe in der Klärlösung geklärt und erneut auf die gleiche Weise in der Klärlösung abgebildet. Die erhaltenen Bilder wurden auf eine Radial-Umfangsebene (r − θ) projiziert (Standardabweichungsprojektion), um die Sichtbarkeitstiefe in jeder Bedingung zu demonstrieren.

Eine ringförmige Probe mit einer axialen Länge von 1 mm wurde aus einer anderen isolierten Rattenaorta durch Schneiden in einer Ebene quer zur Längsachse der Aorta hergestellt. Nach der Fluoreszenzmarkierung der Kerne glatter Muskelzellen in der Probe mit 5 µM Ethidium homodimer-III (Biotium) in PBS über Nacht bei 4 °C wurde die Probe unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop (Nikon) in einem ungeklärten, normalen Zustand abgebildet Zustand innerhalb von PBS. Bilder auf der Radial-Umfangsebene (r − θ), die alle Schichten von Elastinfasern, glatten Muskelzellen und Kollagenfasern wie oben beschrieben erfassen. Eine Tiefenserie von Bildern, die jeweils aus 512 × 512 Pixeln bestand und einen quadratischen Bereich von 347 µm abdeckte, wurde mit einer Rate von 0,5 fps und einer 2-fachen Mittelung mit einem Intervall von 0,5 µm aufgenommen, bis die Signale nicht mehr nachweisbar waren. Anschließend wurde die Probe in der Klärlösung geklärt und erneut auf ähnliche Weise in der Klärlösung abgebildet.

Um das mechanische Verhalten der Aorta mit/ohne Gewebereinigung zu charakterisieren, wurde ein Druck-Durchmesser-Test mit drei Tieren durchgeführt. Jedes Ende der Aortenprobe wurde an einer maßgeschneiderten Hohllehre aus rostfreiem Stahl befestigt und mit einem Testgerät (Abb. 2a) verbunden, das den in früheren Studien13,14 verwendeten ähnelte, wobei die Bauchseite nach oben zeigte (Abb. 3). ). Die Länge der Teststrecke betrug mindestens 20 mm. Der Test wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, während die Probe in einem mit PBS gefüllten Bad der Vorrichtung gehalten wurde. Der intraluminale Druck wurde mit einer Handpumpe bereitgestellt und mit einem Quecksilbermanometer (Navis, Japan) überwacht. Die Bilder der Aorta wurden mit einer CCD-Kamera (Coupled-Charged Device) (DFC310, Leica, Deutschland) aufgenommen, die mit einem Stereomikroskop (M165 FC, Leica) ausgestattet war. Die Probe wurde auf ihre In-vivo-Länge gedehnt und als Vorkonditionierung wurden 10 Aufblas- und Entleerungszyklen mit PBS zwischen 0 und 200 mmHg durchgeführt. Darauf folgte ein einziger Inflations- und Deflationszyklus; Zur Datenanalyse wurde das Bild der Aorta bei jedem Druckanstieg von 20 mmHg während des Aufblasens und bei jeder Drucksenkung um 20 mmHg während des Entleerens aufgenommen. Die Probe wurde von der Testvorrichtung abgenommen und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in die Reinigungslösung gelegt, bis die Aorta vollständig gereinigt war. Das Testprotokoll wurde erneut durchgeführt, wobei die Probe in der Klärlösung belassen wurde (Abb. 3). Die Testreihe wurde am selben Tag der Entnahme der Aorta durchgeführt.

Weitere drei Tiere wurden für die dynamische Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet. Die Aortenprobe wurde wie oben beschrieben entnommen und die Zellkerne wurden mit Ethidium homodimer-III (Biotium), gelöst bei 5 µM in PBS, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe gefärbt. Anschließend wurde die Probe in der Klärlösung, die 5 µM Ethidiumhomodimer-III enthielt, über Nacht bei 4 °C auf einer Wippe geklärt. Zur mikrostrukturellen Beobachtung der Aorta während der intraluminalen Druckbeaufschlagung wurde die Probe mit der Bauchseite nach oben zeigend und gestreckt an derselben Testvorrichtung befestigt, die auch für den Druck-Durchmesser-Test verwendet wurde, montiert auf einem motorisierten Tisch des Zwei-Photonen-Mikroskops (Nikon). die In-vivo-Länge. Für die Multiphotonenmikroskopie wurde das System leicht modifiziert (Abb. 2b). Die Aorta wurde in dem mit der Klärlösung gefüllten Bad gehalten und intraluminaler Druck als hydrostatischer Druck ausgeübt, indem die Höhe eines mit gesättigter Kochsalzlösung gefüllten Reservoirs (25-ml-Spritze) verändert wurde. Die Kochsalzlösung im Reservoir und die Klärlösung in der Probe waren über eine einzige Luftblase verbunden, die in den Strömungskreislauf eingeführt wurde. Der Druckpegel wurde mit einem Druckwandler (DX-100, Nihon Koden, Japan) überwacht, der sich am Ende der Probe gegenüber dem Ende befand, das mit dem Reservoir verbunden war.

Zur Vorkonditionierung wurden zehn Zyklen des Aufpumpens und Entleerens der Aorta durch Anwendung des intraluminalen Drucks zwischen 0 und 160 mmHg durchgeführt. Darauf folgte eine serielle Anwendung von 0, 40, 70, 100 und 130 mmHg auf die Probe; Mikroskopische Bilder wurden bei jedem Druckschritt wie folgt aufgenommen. Um Veränderungen der mikroskopischen Struktur der Aorta während der Druckbeaufschlagung zu charakterisieren, wurden drei Hauptkomponenten der Aorta, nämlich Elastin, glatte Muskelzellen und Kollagen, gleichzeitig in der gesamten Aortenwand abgebildet, von der innersten intimalen Elastinschicht bis zum äußersten Adventitia-Kollagen Schicht. Es wurde eine Tiefenserie bestehend aus insgesamt bis zu 200 Bildern mit einem Abstand von 0,67 bzw. 1 µm aufgenommen; Jedes Bild mit einer Größe von 512 × 512 Pixeln, das einen quadratischen Bereich von 347 µm abdeckt, wurde mit einer Rate von 0,5 fps und einer 2-fachen Mittelung aufgenommen. Die Laserintensität und die Empfindlichkeit des Photomultipliers an jedem Kanal wurden fein abgestimmt, um Lichthöfe zu vermeiden.

In den erhaltenen mikroskopischen Bildern wurden Veränderungen in der Ausrichtung der elastischen Fasern in jeder elastischen Schicht und der Zellkerne der glatten Muskulatur in jeder Schicht der glatten Muskulatur bewertet; Zwei von drei Proben wiesen eine niedrige Kollagen-SHG-Intensität auf, sodass die Analyse der Kollagenfaserausrichtung nur mit einer Probe durchgeführt werden konnte. Um repräsentative Regionen in jedem EL und SML bei jedem Druckschritt zu identifizieren, wurde aus den gesamten Tiefenserienbildern von EL und SML ein quadratischer Bereich mit 256 × 256 Pixeln ausgeschnitten, der die markantesten Spitzen und Täler im Profil der durchschnittlichen Signalintensität lieferte jedes Bildausschnitts entlang der Tiefenposition (Abb. 5). Die Tiefenposition jedes der 6 Peaks für EL und 5 Peaks für SML wurde identifiziert, und der entsprechende Tiefenschnitt wurde als repräsentatives Bild von jedem von EL und SML ausgewählt und für die anschließende Analyse verwendet.

Die Ausrichtung der elastischen Fasern und der Zellkerne der glatten Muskulatur wurde in den Tiefenserienbildern sowie in den ausgewählten EL- und SML-Bildern mithilfe der Direktionalitätsfunktion in ImageJ/Fiji (Version 2.1.0, NIH, USA) bewertet. Dabei wurde eine zweidimensionale schnelle Fourier-Transformation (2D-FFT) durchgeführt und die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion der Gaußschen Verteilung an die Winkelverteilung der elastischen Fasern/Kerne in den Bildern angepasst. Aus der Analyse wurden drei Parameter gewonnen, die ihre Ausrichtung beschreiben: der Peak (Grad) und die Streuung (ohne Einheit) der angepassten Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion sowie die Güte der Anpassung (ein einheitenloser Wert im Bereich zwischen 0 und 1). Unter den drei Parametern verwendeten wir den Spitzenwert als repräsentativen Ausrichtungswinkel der elastischen Fasern/Zellkerne. Darüber hinaus wurden Änderungen im gesamten durchschnittlichen Peak-Ausrichtungswinkel von ELs und SMLs in einer Probe der gesamten Aorta ausgewertet, indem einfach der Mittelwert und die Standardabweichung des Peaks sowie die Streuung aller ELs und SMLs von jeweils zwei Proben berechnet und verglichen wurden Druckstufe.

Um die Verformung jedes EL-, SML- und Kollagenfasernetzwerks in EL und SML zu bewerten, wurde eine bildbasierte Spannungsanalyse durchgeführt. Vom vollständigen Tiefenstapel jeder Komponente bei jedem Druckschritt wurden Unterstapelbilder gesammelt, die die gesamte Dicke jeder Schicht abdeckten; Die Tiefenposition jeder Schicht wurde durch visuelle Inspektion von Bildern der r − θ-Ebene (radial-umfangsmäßig) bestimmt, die aus den ursprünglichen Tiefenstapelbildern der z − θ-Ebene (axial-umfangsmäßig) rekonstruiert wurden. Alle Bilder in jedem Unterstapel wurden summiert, um ein projiziertes Bild zu erstellen, und insgesamt wurden 5 projizierte Bilder (entsprechend 0, 40, 70, 100 und 130 mmHg) gestapelt.

Um Dehnungsmarkierungen festzulegen, wurden charakteristische Objekte in jedem Bildstapel, die während der gesamten Stapelserie verfolgt werden konnten, manuell um die horizontale Mittellinie der Bilder herum ausgewählt. In EL-Bildern waren diese charakteristischen Merkmale helle Flecken im elastischen Fasernetzwerk; Dies waren typische Zellkerne bei SML. Für die Umfangsdehnung wurden zwei Markierungen gepaart, die ungefähr an den gleichen horizontalen Stellen entlang der horizontalen Mittellinie positioniert waren. Der Abstand zwischen den gepaarten Markierungen wurde bei jedem Druckschritt aufgezeichnet und die Nenndehnung für die Umfangsrichtung berechnet. In jedem Stapel wurden mindestens drei Markerpaare zur Dehnungsmessung verwendet. In ähnlicher Weise wurden zwei Marker, die ungefähr an den gleichen vertikalen Positionen positioniert waren, gepaart und zur Bestimmung der axialen Dehnung verwendet.

Statistische Analysen wurden mit der Statistiksprache R (Version 4.3.0) durchgeführt. Vergleiche zwischen mehr als zwei Gruppen wurden mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests durchgeführt, gefolgt von einem Steel-Dwass-Mehrfachvergleichstest, wenn im Kruskal-Wallis-Test statistische Signifikanz gefunden wurde. Beim Vergleich der Ausrichtungswinkelverteilung wurde der Dunnett-Test verwendet, wobei die Daten von 0 mmHg als Kontrolle dienten. Die Signifikanz des Unterschieds zwischen zwei unabhängigen Korrelationen wurde mithilfe des R-Pakets cocor40 bewertet und die z-Statistik von Fisher wurde berechnet. In allen Tests wurde das Signifikanzniveau auf P < 0,05 festgelegt.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die vorliegende Studie wurde teilweise von JSPS KAKENHI (Nr. 18K12028, 15H05860, 18H03752, 19K22960), JSPS Platforms for Advanced Technologies and Research Resources „Advanced Bioimaging Support“ (JP16H06280) und AMED-CREST Grant Nummer JP19gm0810005 unterstützt. Die Autoren möchten der Abteilung für medizinische Forschungstechnik der Nagoya University Graduate School of Medicine für die Verwendung des Zwei-Photonen-Mikroskops (A1RMP, Nikon) danken.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Eijiro Maeda und Yoriko Ando.

Biomechanik-Labor, Abteilung für mechanische Systemtechnik, Graduate School of Engineering, Universität Nagoya, Furo-cho, Chikusa-ku, Nagoya, Aichi, 464-8603, Japan

Eijiro Maeda, Yoriko Ando, ​​​​Kazuhiro Takeshita und Takeo Matsumoto

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EM führte Experimente durch, analysierte die Daten und erstellte das Manuskript. YA konzipierte die Studie, entwarf und führte Experimente durch und sammelte und analysierte die Daten. KT führte Experimente durch und sammelte die Daten. TM konzipierte die Studie, analysierte die Daten und stellte das Manuskript fertig. EM und YA haben gleichermaßen zu dieser Studie beigetragen.

Korrespondenz mit Takeo Matsumoto.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Maeda, E., Ando, ​​Y., Takeshita, K. et al. Durch die gereinigte Aorta: Dreidimensionale Charakterisierung des mechanischen Verhaltens der Brustaorta der Ratte unter intraluminaler Druckbeaufschlagung unter Verwendung der optischen Reinigungsmethode. Sci Rep 12, 8632 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12429-5

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Eingegangen: 09. Dezember 2021

Angenommen: 09. Mai 2022

Veröffentlicht: 23. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12429-5

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