Strukturelle Grundlage für die Lipid- und Kupferregulation des ABC-Transporters MsbA

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7291 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Ein entscheidender Schritt in der Lipopolysaccharid (LPS)-Biogenese besteht darin, Lipoigosaccharid, einen LPS-Vorläufer, vom zytoplasmatischen zum periplasmatischen Blättchen der inneren Membran umzudrehen, ein Vorgang, der vom ATP-bindenden Kassettentransporter MsbA durchgeführt wird. Obwohl die Bindung von LPS an den inneren Hohlraum von MsbA gut bekannt ist, ist die Selektivität der MsbA-Lipid-Wechselwirkungen an anderen Stellen noch kaum verstanden. Hier verwenden wir native Massenspektrometrie (MS), um MsbA-Lipid-Wechselwirkungen zu charakterisieren und Strukturstudien zu leiten. Wir zeigen, dass der Transporter zusammen mit Kupfer(II) reinigt und die Metallbindung Protein-Lipid-Wechselwirkungen moduliert. Dargestellt wird eine Struktur mit einer Auflösung von 2,15 Å einer N-terminalen Region von MsbA im Komplex mit Kupfer(II), die eine Struktur zeigt, die an das GHK-Peptid, einen hochaffinen Kupfer(II)-Chelator, erinnert. Unsere Ergebnisse zeigen konformationsabhängige Lipidbindungsaffinitäten, insbesondere für den LPS-Vorläufer 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonsäure (Kdo)2-Lipid A (KDL). Wir berichten über eine Struktur von MsbA mit einer Auflösung von 3,6 Å, die in einer offenen, nach außen gerichteten Konformation mit Adenosin-5'-diphosphat und Vanadat eingeschlossen ist und eine ausgeprägte KDL-Bindungsstelle offenbart, an der das Lipid umfangreiche Wechselwirkungen mit dem Transporter eingeht. Weitere Studien belegen, dass die äußere KDL-Bindungsstelle konserviert ist und ein positiver allosterischer Modulator der ATPase-Aktivität ist, der als Feedforward-Aktivierungsmechanismus dient, um die Transporteraktivität mit der LPS-Biosynthese zu koppeln.

Ein charakteristisches Merkmal der meisten gramnegativen Bakterien ist das Vorhandensein von Lipopolysaccharid (LPS) im äußeren Blättchen der Außenmembran1,2,3. LPS trägt zur Bildung einer undurchlässigen Barriere bei, die Bakterien hilft, Antibiotika und Umweltstress zu widerstehen2. Die Biogenese von LPS beginnt im Zytoplasma mit der Produktion des LPS-Vorläufers Lipoigosaccharid (LOS), gefolgt von einem orchestrierten Transport zur Zelloberfläche und weiteren Modifikationen (Abb. 1a)4. LOS enthält eine konservierte Lipid-A-Einheit, ein bisphosphoryliertes Disaccharid von Glucosamin (GlcN) mit vier bis sieben Acylketten, das mit 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonsäure (Kdo)-Zucker1 verziert ist. Zur weiteren Dekoration gehört die Anbringung eines Kernoligosaccharids, das bei verschiedenen Bakterien unterschiedlich ist2. Der zytoplasmatische LOS wird vom inneren zum periplasmatischen Blättchen der inneren Membran umgedreht, ein wesentlicher Schritt, der vom ATP-Binding Cassette (ABC)-Transporter MsbA ausgeführt wird. Da die Hemmung oder Löschung von MsbA tödlich ist5, hat sich der Transporter zu einem attraktiven Ziel für die Entwicklung von Antibiotika entwickelt. Kürzlich wurden niedermolekulare MsbA-Inhibitoren entwickelt, die sich in ihrer Wirkungsweise unterscheiden, z. B. indem sie den Transporter in einer nach innen gerichteten Konformation (IF) einfangen oder die Substratbindung nachahmen6,7,8,9,10.

Im Zytoplasma beginnt eine Lipopolysaccharid-Biosynthese zur Erzeugung von Lipoigosaccharid (LOS). LOS besteht aus einer konservierten Lipid-A-Struktur (grau), einem bisphosphorylierten Disaccharid von Glucosamin, modifiziert mit 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonsäure (Kdo)-Zucker (orange) und einem Kernoligosaccharid (lila). ist auf die Bakterien angewiesen. MsbA, angetrieben durch die Hydrolyse von ATP, kippt den zytoplasmatischen LOS vom inneren zum äußeren Blättchen der inneren Membran um, ein wesentlicher Schritt in der LPS-Biogenese. Das umgedrehte LOS wird zusammen mit weiteren Modifikationen zur äußeren Membran transportiert, um zu LPS zu werden. b Das native Massenspektrum optimierter MsbA-Proben in C10E5 ergibt ein gut aufgelöstes Massenspektrum. c Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (KD) für einzelne Lipidbindungsereignisse an teilweise beladenes MsbA. d Entfaltung des Massenspektrums, dargestellt in Tafel b. Die verschiedenen Molekülspezies entsprechen dimerem MsbA und einer unterschiedlichen Anzahl gebundener Kupferionen. e Die gemessene Masse von MsbA nach der Beladung mit Kupfer(II) zeigt die Sättigung zweier Bindungsstellen. f KDs für einzelne Lipidbindungsereignisse an vollständig mit Kupfer(II) beladenes MsbA. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung (n = 3, biologische Replikate). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Eine Reihe von Studien, die ein Arsenal biophysikalischer Techniken verwendeten, lieferten mechanistische und strukturelle Einblicke in MsbA6,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. MsbA bildet ein Homodimer, jede Untereinheit besteht aus einer Transmembrandomäne (TMD, sechs Transmembranhelices pro Untereinheit) und einer Cytosol-exponierten Nukleotidbindungsdomäne (NBD)21. Der vorgeschlagene Mechanismus, durch den MsbA LOS durch die Doppelschicht transloziert, umfasst mehrere Schritte6,17. An Apo oder Adenosin-5'-diphosphat (ADP) gebundenes MsbA besetzt eine IF-Konformation mit räumlich getrennten NBDs und fördert so den Eintritt und die Bindung des sperrigen LOS. Die Bindung von LOS im zentralen, inneren Hohlraum und Adenosin-5'-triphosphat (ATP) an MsbA fördert die Dimerisierung der NBDs. Die ATP-Hydrolyse bewirkt eine Konformationsänderung in eine nach außen gerichtete (OF) Konformation und transportiert LOS zur periplasmatischen Seite der inneren Membran. LOS und anorganisches Phosphat werden freigesetzt und MsbA kehrt in eine IF-Konformation zurück. Wie bei vielen anderen ABC-Transportern wird die ATPase-Aktivität von MsbA in Gegenwart verschiedener Substrate stimuliert, insbesondere hexaacylierter Lipid-A-Spezies wie 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonsäure (Kdo)2-lipid A ( KDL)22,23,24. Obwohl die hochselektive Erkennung von LPS in der inneren Höhle durch MsbA gut verstanden ist6,17, ist die strukturelle Grundlage der Stimulierung der MsbA-ATPase-Aktivität für die Bindung von Lipiden an andere Stellen noch wenig verstanden.

Die native Massenspektrometrie (MS) hat sich zu einer unverzichtbaren biophysikalischen Technik zur Untersuchung von Membranproteinkomplexen und ihren Wechselwirkungen mit Lipiden und anderen Molekülen entwickelt25. Mit der Fähigkeit, nichtkovalente Wechselwirkungen und die nativähnliche Struktur von Membranproteinen in der Gasphase zu bewahren26,27, hat die Technik aufschlussreiche Informationen über verschiedene biochemische Wechselwirkungen einschließlich Nukleotid-, Arzneimittel-, Peptid- und Lipidbindung sowie thermodynamische Daten dafür geliefert Protein-Protein-, Protein-Ligand- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen28,29,30,31,32,33,34,35. In dieser Studie wollten wir MsbA-Lipid-Wechselwirkungen in verschiedenen Konformationszuständen charakterisieren: Apo, nach innen gerichtet; und Vanadat-gefangen, nach außen gerichtet. Native MS-Studien zeigen, dass MsbA zusammen mit Kupfer(II) gereinigt wird, aber auch MsbA-Lipid-Wechselwirkungen werden direkt durch Metallbindung und Proteinkonformation beeinflusst. Strukturstudien zeigen eine KDL-Bindungsstelle, die bisher in anderen ABC-Strukturen nicht beobachtet wurde. Unsere Ergebnisse bringen neue Einblicke in die Metall- und Lipidregulation von MsbA.

Da berichtet wurde, dass MsbA gemeinsam mit LPS und anderen Lipiden gereinigt wird17,36, bestand unser erstes Ziel darin, die Reinigung von MsbA aus E. coli für native MS-Studien zu optimieren. Das Massenspektrum von MsbA, das im Detergens n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM) gereinigt wurde, war ein breiter Buckel (ergänzende Abbildung 1), was auf eine äußerst heterogene Probe hinweist, die einer Batterie mitgereinigter kleiner Molekülverunreinigungen entspricht. Die scharfen Massenspektralpeaks, die den darunter liegenden Buckel zieren und bei etwa 4500 m/z zentriert sind, entsprechen dem monomeren MsbA, das aus der Dissoziation des Homodimers unter den nicht-nativen Bedingungen mit hoher Aktivierung resultiert. Nach Anwendung einer etablierten Detergens-Screening-Methode zur Optimierung der Proteinreinigung (siehe Ergänzende Anmerkung 1)37 zeigten im Detergens Pentaethylenglykolmonodecylether (C10E5) solubilisierte MsbA-Proben ein gut aufgelöstes Massenspektrum (Abb. 1b). Die MsbA-Proben hydrolysierten im Laufe der Zeit auch ATP, was durch das Vorhandensein von ADP deutlich wird, wohingegen MsbA mit der E506Q-Mutation, die die katalytische Aktivität aufhebt, kein ATP umsetzte (ergänzende Abbildung 1c – d). Interessanterweise werden verschiedene molekulare Spezies gemessen, die dimerem MsbA und der Zugabe von einem bis drei ~65 Da-Addukten entsprechen (Abb. 1d und Ergänzungstabelle 1). Die Analyse von MsbA-Proben mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) identifizierte die gebundenen Addukte als Kupfer (Ergänzungstabellen 2–3). Durch die Zugabe von Kupfer(II) zu MsbA wurden die beiden Bindungsstellen gesättigt (Abb. 1e). Die Entfernung von überschüssigem Kupfer(II) und die Zugabe des Kupfer(II)-Chelators Trientin39 reduzierten die Menge des an MsbA gebundenen Metalls (ergänzende Abbildung 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass MsbA über eine hochaffine Kupfer(II)-Bindungsstelle pro Untereinheit verfügt.

Um die Wechselwirkungen zwischen MsbA und Lipiden besser zu verstehen, haben wir Gleichgewichtsbindungskonstanten für die Bindung von MsbA an verschiedene Lipide bestimmt. Für diese Studien wählten wir 1,1′,2,2′-Tetraoleoyl-Cardiolipin (TOCDL, 72:4) oder Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG) und Phosphatidylserin (PS) mit der Acylkettenzusammensetzung 1-Palmitoyl-2-oleoyl (PO, 16:0–18:1). Wir haben auch 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonsäure (Kdo)2-Lipid A (KDL) einbezogen, einen LPS-Vorläufer, von dem bekannt ist, dass er die MsbA-ATPase-Aktivität stimuliert22,23,24. Mit Ausnahme von PC kommen diese Lipide in E. coli vor40. Teilweise und vollständig mit Kupfer (II) beladenes MsbA wurde mit jedem Lipid titriert und anschließend deren native Massenspektren aufgezeichnet (Ergänzende Abbildungen 3–6). Die Stoffmengenanteile der Apo- und Lipid-gebundenen Zustände von MsbA wurden aus den entfalteten MS-Daten extrahiert und zur Bestimmung der Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KDN) für das N-te Bindungsereignis verwendet (Ergänzungstabellen 4–5). Mit Kupfer (II) beladenes MsbA führte zu einer statistisch signifikanten Verbesserung der Bindungsaffinitäten für POPA und POPS (Abb. 1c – f und ergänzende Abb. 7). Die beiden am stärksten bindenden Lipide für mit Kupfer(II) beladenes MsbA waren TOCDL (KD1 = 1,6 µM) und KDL (KD1 = 0,6 µM). Die POPG-Bindungsaffinitäten waren weitgehend unabhängig vom Kupfer(II)-gebundenen Zustand von MsbA. Kurz gesagt, diese Ergebnisse zeigen, dass MsbA nicht nur selektiv an Lipide bindet, sondern auch vom Grad der Kupfer(II)-Bindung an den Transporter abhängt.

Über zwei mutmaßliche Metallbindungsstellen für ein MsbA wurde bereits berichtet41. Durch die Mutation einer der mutmaßlichen Stellen (H562A und H576A) wurde die Kupfer(II)-Bindung nicht aufgehoben (ergänzende Abbildung 2). Nach sorgfältiger Untersuchung der MsbA-Strukturen mit Schwerpunkt auf Histidin- und Cysteinresten, von denen beide bekanntermaßen Kupfer bevorzugt koordinieren42, stellten wir fest, dass in allen MsbA-Strukturen das N-terminale Histidin nicht beobachtet wird, was wahrscheinlich auf einen flexiblen Linker oder eine unterschiedliche Population zurückzuführen ist Strukturen. Durch die Entfernung der ersten vier Reste (Met-His-Asn-Asp) von MsbA wurde die Bindung von Kupfer(II) aufgehoben (Abb. 2a), wodurch die Metallbindungsstelle am N-Terminus fixiert wurde. Zusätzliche Studien zeigen, dass das verkürzte, kupfer(II)-freie Protein keine veränderte ATPase-Aktivität in Detergens oder Proteoliposomen aufweist (ergänzende Abbildung 8). Da gezeigt wurde, dass das initiierende Met für einige bakterielle Proteine entfernt wurde43, exprimierten und reinigten wir MsbA mit einem C-terminalen Affinitätstag und stellten fest, dass es einen intakten N-Terminus behält, der auch Kupfer(II) binden kann (ergänzende Abbildung 2). Interessanterweise zeigen MD-Simulationen44, dass sich der N-Terminus von MsbA in verschiedenen Strukturen in der Nähe der inneren Membran und in einem Bereich befindet, in dem LOS passieren könnte, bevor es in den inneren Hohlraum gelangt (Abb. 2b und ergänzende Abbildung 9).

a Natives Massenspektrum und Entfaltung von MsbA mit Deletion von vier N-terminalen Resten. An den verkürzten Transporter ist kein Kupfer(II) gebunden. b Schnappschuss einer Molekulardynamiksimulation von MsbA in einer 16:0 PC (DPPC)-Doppelschicht (PDB 6BPP heruntergeladen von MemProtMD44). DPPC wird in Stick-Darstellung (grau) dargestellt. Das Protein wird in einer Cartoon-Darstellung mit den rosafarbenen Resten 4–8 dargestellt. Das gelbe Kästchen markiert die Position des N-Terminus relativ zur inneren Membran. c Struktur des N-Terminus von MsbA (Reste 1–4), fusioniert mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP), das Kupfer(II) koordiniert. Das N-terminale Peptid ist in Stabdarstellung dargestellt, wobei Wasser (blau) und Kupfer(II) als Kugeln dargestellt sind. Anleihen werden als gestrichelte Linien (Limon) dargestellt. Anomaler Differenzpeak in Magenta dargestellt und bei 15 Sigma konturiert. Die Struktur von GFP wird der Übersichtlichkeit halber weggelassen. d Ausrichtung des an Kupfer(II) gebundenen N-terminalen MsbA-Peptids mit dem GHK-Kupfer(II)-Komplex (CCDC-809108, Cα violett gefärbt).

Um die Strukturbestimmung zu erleichtern, wurde die N-terminale Sequenz von MsbA auf Proteine aufgepfropft, von denen bekannt ist, dass sie leicht kristallisieren. Native MS zeigt, dass diese Fusionsproteine ein Fragment des N-Terminus von MsbA aus gebundenem Kupfer (II) variabler Länge und Monomer enthalten (ergänzende Abbildung 10). Eine der Fusionen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), die die Reste 1–4 von MsbA enthielt, erzeugte Kristalle in Röntgenqualität, die zur Strukturbestimmung mit einer Auflösung von 2,15 Å führten (Ergänzungstabelle 6). Die aufgelöste Elektronendichte für den N-Terminus wird zusammen mit einem starken anomalen Signal für das gebundene Kupferion beobachtet (Abb. 2c und ergänzende Abb. 11) und nimmt eine ähnliche Struktur an wie das Kupfer(II)-koordinierte GHK-Peptid, ein natürliches Peptid vorkommender hochaffiner Kupfer(II)-Chelator im Blutplasma (Abb. 2d)45. Das Kupfer(II) nimmt eine pseudooktaedrische Koordination mit den planaren Liganden ein, die aus dem Amin von M1, dem Amid und der Seitenkette von H2 bestehen. Eine zusätzliche Wechselwirkung wird durch die Seitenkette von D197' aus einem symmetriebezogenen Molekül gebildet (ergänzende Abbildung 10c) und ähnelt der GHK-Kupfer(II)-Struktur, bei der es sich um ein C-terminales Carboxylat handelt. Die axialen Liganden von Kupfer(II) sind Wasser, von denen einer eine Brücke zwischen Kupfer und der Seitenkette und dem Amid von N3 bildet. Diese Wechselwirkung stellt einen Kristallkontakt dar und die Koordination unterscheidet sich vom GHK-Peptid in den axialen Gewässern und von N3, das an einer Wasserbrücke zum Metallion beteiligt ist (Abb. 2d)46. Der Unterschied zwischen den beiden Strukturen legt nahe, dass die dritte Position variabel sein kann. Angesichts der Nähe des N-Terminus zum inneren Blättchen (Abb. 2b und ergänzende Abb. 11) könnte die an Kupfer (II) gebundene Struktur die Lipid-Kopfgruppe angreifen, was zu einer erhöhten Lipidbindungsaffinität führt. Die Analyse von ABC-Transportersequenzen zeigt, dass mehr als 400 Proteine ein Histidin an zweiter Position enthalten, darunter einige mit einer N-terminalen Sequenz von MHK, und möglicherweise für andere ABC-Transporter relevant sind.

Um den Einfluss der MsbA-Konformation auf die Lipidbindungsaffinität zu bestimmen, wurden analoge Experimente mit MsbA durchgeführt, das in einer offenen OF-Konformation mit Adenosindiphosphat (ADP) und Vanadat (VO4) eingeschlossen war. Die native Massenmessung zeigt, dass jede Untereinheit des Transporters an Kupfer(II)-, ADP- und VO4-Moleküle gebunden ist (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 1). Die Dissoziationskonstanten zeigten, dass MsbA in der offenen OF-Konformation eine höhere Lipidbindungsaffinität für eine Untergruppe von Lipiden aufwies (Abb. 3d und ergänzende Abb. 12–14 und ergänzende Tabelle 7). In Gegenwart von 0,4 μM KDL bindet beispielsweise Vanadat-gefangenes MsbA bis zu zwei Lipide, während das nicht-gefangene Protein nur ein KDL bindet (Abb. 3b – c). Insbesondere die Bindungsaffinität für KDL (KD1 = 0,3 µM) erhöhte sich im Vergleich zum nicht eingeschlossenen Protein deutlich um das Zweifache (Abb. 3d). Interessanterweise war die Änderung der KD bei jedem nachfolgenden Lipidbindungsereignis deutlich verringert, ein Hinweis auf eine starke positive Kooperativität. Die Bindung von POPC und POPE erinnert an die Bindung von teilweise mit Kupfer(II) beladenem MsbA. POPA und POPG zeigten insgesamt einen leichten Anstieg der Bindungsaffinität. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass unterschiedliche Konformationszustände von MsbA Lipide mit unterschiedlichen Affinitäten binden.

a Repräsentatives Massenspektrum von MsbA, gefangen mit ADP·VO4 und in Gegenwart von 0,4 μM KDL. b Dekonvolution des Massenspektrums, gezeigt in Panel a. c Entfaltetes Massenspektrum von nicht eingefangenem MsbA in Gegenwart der gleichen Menge KDL. Es wird eine signifikante Verringerung der KDL-Bindung an MsbA beobachtet. d KD-Werte für einzelne Lipidbindungsereignisse an mit ADP und Vanadat eingefangenes MsbA. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung (n=3, biologische Replikate). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da KDL Kupfer(II)-gebundenes MsbA mit einer Affinität bindet, die größer ist als die der anderen Lipide, haben wir mit ADP und Vanadat (62 µM) eingeschlossenes MsbA in Gegenwart eines zweifachen molaren Überschusses an KDL (124 µM) in C10E5 für Kryo vorbereitet -Elektronenmikroskopische (KryoEM)-Studien. Die Struktur des Komplexes wurde mit einer Auflösung von 3,6 Å bestimmt (Abb. 4a, ergänzende Abbildungen 15–16, ergänzende Tabelle 8 und ergänzende Anmerkung 2). Die Struktur ähnelt der des Vanadat-eingeschlossenen MsbA aus S. typhimurium, unterscheidet sich jedoch von den zuvor berichteten Vanadat-eingeschlossenen, verschlossenen MsbA-Strukturen 17, 47, hauptsächlich im TMD (ergänzende Abbildung 17). Eine zusätzliche Dichte wird zentriert auf TM5 in einer Region innerhalb der zytoplasmatischen Packungsbeilage der inneren Membran beobachtet, in der KDL direkt in diese Dichte modelliert werden könnte (Abb. 4a). Die Position von KDL unterscheidet sich von der inneren Bindungsstelle6,17 und der mutmaßlichen äußeren Bindungsstelle19, die sich auf der gegenüberliegenden Seite der inneren Membran befindet (Abb. 5). Die elektrostatische Oberfläche von MsbA zeigt, dass die Kopfgruppe von KDL an einen großen, basischen Fleck gebunden ist (Abb. 4b). Es konnten Acylketten von KDL modelliert werden, die mit der hydrophoben Oberfläche von MsbA interagieren (Abb. 4c). Zwischen KDL und MsbA bilden sich umfangreiche Wechselwirkungen mit einer Grenzflächenfläche von 2779 Å2. Die charakteristischen Phosphoglucosamin (P-GlcN)-Substituenten von LOS werden auf der einen Seite durch R238 und auf der anderen Seite durch R188 und K243 koordiniert (Abb. 4d). Darüber hinaus interagieren R236, Q240 und K243 mit einer der Kdo-Gruppen von LOS (Abb. 4d). Wir stellen auch fest, dass die hier verwendete KDL-Konzentration viel geringer ist als die, die für die Strukturen von MsbA-gebundenem G907 oder TBT1 verwendet wird, in denen 1 mM und 400 µM des jeweiligen Arzneimittels verwendet wurden6,8. Dadurch wird die spezifische Bindung von KDL an die Außenstelle weiter verstärkt. Darüber hinaus gibt es eine klare Dichte für ADP·VO4 in den NBDs, koordiniert durch ein Netzwerk konservierter Reste (Abb. 4e und ergänzende Abb. 18). Kurz gesagt könnte die hier identifizierte äußere KDL-Bindungsstelle eine Rolle bei der Regulierung der MsbA-Funktion spielen.

eine Kryo-EM-Rekonstruktion (3,6 Å) von MsbA(ADP·VO4) im Komplex mit KDL. Die Dichte für KDL wird in Gelb angezeigt, und die MsbA-Untereinheiten werden in Rosa und Blau angezeigt. b Das elektrostatische Coulomb-Potenzial (Skalenbalken –10 bis +10, berechnet von ChimeraX62) ist für negative bzw. positive Ladungen rot und blau gefärbt. KDL und interagierende Reste werden in Kugel-Stab-Darstellung dargestellt. c MsbA mit hydrophilen und hydrophoben Oberflächen in den Farben Blau bzw. Gold. d Unterschiedliche Ansichten von KDL gebunden an MsbA. KDL und interagierende Reste in Stabdarstellung dargestellt. Anleihen werden als gestrichelte gelbe Linien dargestellt. Rückstände sind gekennzeichnet. e Ansicht des gebundenen ADP·VO4 und der interagierenden Reste, dargestellt wie in d beschrieben.

Die Strukturen werden in Cartoon-Darstellung dargestellt, wobei Lipide (sofern vorhanden) in orangefarbenen Kugeln dargestellt sind. Es werden zwei Ansichten angezeigt (0 und 90°). Dargestellt sind die äußere Bindungsstelle a (diese Arbeit), die innere Bindungsstelle b (PDB 6BPL)6,17 und die mutmaßliche äußere Bindungsstelle c (PDB 6BL6)19,64. In Tafel c war die Dichte nicht klar genug, um das Lipid zu modellieren, und die mutmaßliche Stelle ist durch einen roten Kreis gekennzeichnet19. d Sequenzlogo der mit KDL interagierenden Reste (83, 87, 188, 236, 238, 240 und 243), basierend auf einem Alignment von 258 MsbA-Sequenzen aus der gesamten Bakterienphylogenie.

Die hier entdeckte einzigartige KDL-Bindungsstelle offenbart ein evolutionär konserviertes Merkmal von MsbA. Die Reste (R188, R238 und K243), die die charakteristischen P-GlcN-Substituenten von LOS binden, bleiben konserviert (Abb. 5d). Ähnliche Wechselwirkungen wurden für die innere LOS-Stelle in MsbA6,17 und die Erkennung von LPS in LptB2FG, einem LPS-ABC-Transporter48, beobachtet. Andere Reste (R236 und Q240), die eine Kdo-Gruppe von KDL koordinieren, sind ebenfalls konserviert (Abb. 5d). Da die meisten LOS gramnegativer Bakterien ein KDL-Molekül synthetisieren, das jenen in E. coli ähnelt3, ist dies aufgrund der Konservierung von Resten und ihrer Wechselwirkung mit KDL ein einzigartiges Merkmal von MsbA im Vergleich zu anderen Transportern. Darüber hinaus erstreckt sich der große, grundlegende Patch, der die KDL-Kopfgruppe umschließt, über die Kdo-Gruppen hinaus, die das Kernoligosaccharid von LOS, die Glykolipid-MsbA-Flips, weiter angreifen könnten. Dieser grundlegende Patch erstreckt sich wahrscheinlich auf andere MsbAs und ist wichtig für die Erkennung von LOS, einschließlich anderer Lipide, deren Struktur in verschiedenen Bakterien unterschiedlich ist2.

Eine Reihe von MsbA-Mutanten, die so konstruiert wurden, dass sie die KDL-Bindung beeinflussen, wurden evaluiert. Einige der mutierten MsbA-Proteine konnten exprimiert und gereinigt werden, waren jedoch biochemisch instabil, da nach der Behandlung mit Vanadat eine Verkürzung des Transporters beobachtet wurde, wie z. B. MsbAY87F, R238A (ergänzende Abbildung 19). MsbA mit den Mutationen R188A und K243A (MsbAR188A, K243A), das so konstruiert wurde, dass es die Wechselwirkung mit einem der P-GlcN-Substituenten von KDL unterbricht, war biochemisch stabil und zur Bestimmung von KDs geeignet (Abb. 6a – c und ergänzende Abb. 20). Für das nicht eingeschlossene Protein erhöhte sich KD1 um das Zweifache und KD2 um das Fünffache. Im gefangenen Zustand stiegen auch KD1 und KD2 statistisch um mehr als das Doppelte an. Da bekannt ist, dass MsbA durch einige Lipide stimuliert wird, haben wir die ATPase-Aktivität von MsbA in Abwesenheit und Anwesenheit von Lipiden bestimmt (Abb. 6d). Wildtyp-MsbA wurde durch KDL in von anderen beobachteten Mengen stimuliert17,22. Allerdings stimulierte RaLPS (LRa), ein LOS mit einem vollständigen E. coli R2-Typ-Kern50, die MsbA-ATPase-Aktivität in höherem Maße (Abb. 6d)22. In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht22 stimulierte Lipid A (LA), ähnlich wie KDL, aber ohne die Kdo-Substituenten, MsbA, jedoch in geringerem Maße, was die Bedeutung der Kdo-Gruppen hervorhebt. MsbAR188A, K243A zeigte einen statistisch signifikanten Rückgang der Stimulation, der unabhängig vom Lipidtyp war (Abb. 6d). Die Lipid-induzierte Stimulation von MsbA mit R78A- und K299A-Mutationen (MsbAR78A, K299A), die so konstruiert wurde, dass sie die Bindung an der inneren Stelle unterbricht (Abb. 5b), wurde ebenfalls bewertet. MsbAR78A, K299A zeigte keine Stimulation durch LA und KDL, aber die Aktivität wurde durch LRa auf das gleiche Niveau wie das Wildtyp-Protein stimuliert (Abb. 6d). Als nächstes untersuchten wir die Reste, die KDL in MsbA-Strukturen koordinieren (Abb. 6e und ergänzende Abb. 21). Mit Ausnahme von R188 befinden sich die mit KDL interagierenden Reste an ähnlichen Positionen. In (verschlossenen und offenen) OF-Zuständen wird TM4 jedoch um etwa 12 Å in Richtung der anderen Reste verschoben, was R188 dazu veranlasst, das P-GlcN von KDL zu aktivieren. Diese zusätzliche Interaktion erklärt die Verbesserung der KDL-Bindungsaffinität. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die äußere KDL-Bindungsstelle eine direkte Rolle bei der allosterischen Stimulierung der MsbA-ATPase-Aktivität spielt.

ein entfaltetes Massenspektrum von 0,3 μM MsbAR188A,K243A in Gegenwart von 0,4 μM KDL. b Entfaltetes Massenspektrum von 0,4 μM Vanadat-eingeschlossenem MsbAR188A,K243A mit der gleichen KDL-Konzentration wie in Tafel a. c KD-Werte für die KDL-Bindung an Wildtyp und mutiertes MsbA. d ATPase-Aktivität von MsbA, MsbAR188A,K243A und MsbAR78A,K299A in Gegenwart und Abwesenheit von 5 μM Lipid A (LA) (*p = 0,047; 0,011), KDL (**p = 0,008; 0,005, *p = 0,019 ) oder Ra-LPS (LRa) (**p = 0,004; 0,009). Zur Prüfung der statistischen Signifikanz wurde ein zweiseitiger Student-T-Test verwendet. e Ausrichtung verschiedener Strukturen an einer Region von TM5, Restbereich von 230 bis 250. Die ersten vier gezeigten Felder (von links nach rechts) entsprechen Apo (dieser Bericht), G907-gebundenem (PDB 6BPL) und Vanadat-gefangenem in einem verschlossene (PDB 7BCW) oder offene (dieser Bericht) MsbA-Strukturen. Das Feld ganz rechts ist eine Überlagerung aller vier Strukturen. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung (n=3, biologische Replikate). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass native Massenspektrometriedaten zeigen, dass MsbA gemeinsam mit Kupfer(II) gereinigt wird, eine Beobachtung, die mit herkömmlichen Methoden unbemerkt bleiben würde, und dass Protein-Lipid-Wechselwirkungen direkt durch die Kupfer(II)-Bindung sowie die Konformation des Proteins beeinflusst werden Transporter. Strukturstudien zeigen, dass der N-Terminus von MsbA Kupfer(II) auf ähnliche Weise koordiniert wie das GHK-Peptid. Die Bindung von Kupfer(II) an MsbA beeinflusst die Lipidbindung, und der N-Terminus befindet sich in der Nähe der Doppelschicht, wo er wahrscheinlich mit Lipidkopfgruppen interagiert. Im weiteren Sinne könnte die Kupfer(II)-Bindung eine regulatorische Rolle spielen, etwa die Kopplung der Kupfer(II)-Spiegel mit der LPS-Biogenese, und bedarf weiterer Untersuchungen. Eine andere Struktur beleuchtet eine ausgeprägte äußere KDL-Bindungsstelle, die ein allosterischer Modulator der ATPase-Aktivität und ein konserviertes Merkmal von MsbA ist. Mutagenesestudien belegen, dass diese äußere allosterische Stelle auch gegenüber hexaacylierten Lipid-A-Spezies wie LA und LRa empfindlich ist. Diese Ergebnisse liefern überzeugende Beweise für einen Feedforward-Aktivierungsmechanismus für MsbA, ein seltenes Kontrollprinzip in Biosynthesewegen, das am besten für Pyruvatkinase51 beschrieben wird und die MsbA-Aktivität an die zelluläre Produktion von zytoplasmatischem LOS und dessen Vorläufern anpasst.

Das msbA-Gen (UniProt P60752) und das pCDF-1b-Plasmid (Novagen) wurden durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, NEB) aus genomischer DNA von Escherichia coli bzw. gereinigtem Plasmid amplifiziert. Die Primer wurden mit dem Online-NEBuilder Assembly Tool (NEB) entworfen und die amplifizierten Produkte wurden vor der HiFi DNA Assembly (NEB) gemäß dem Protokoll des Herstellers gelgereinigt. Das resultierende Konstrukt, pCDF-MsbA, exprimierte MsbA mit einem N-terminalen TEV-spaltbaren His6-Fusionsprotein. Um mutierte Formen von MsbA zu erzeugen, wurden Primer mit dem Online-Tool NEBaseChanger (NEB) entworfen und Mutanten mit dem KLD-Enzymmix (NEB) gemäß dem Protokoll des Herstellers eingeführt. MsbA wurde auch in ein modifiziertes pET15-Plasmid kloniert, um MsbA mit einer durch HRV3C-Protease spaltbaren C-terminalen Fusion an den Superordner GFP52, gefolgt von einem 6x His-Tag, zu exprimieren. Die N-terminale Sequenz von MsbA wurde auf MBP, Superfolder GFP52 und T4-Lysozym gepfropft, indem in das pCDF-MsbA-Plasmid subkloniert wurde und die Reste 1–8 von MsbA erhalten blieben. Eine ähnliche Fusionsstrategie wurde für das GHK-Peptid53 durchgeführt. Die Verkürzung des MsbA-N-Terminus erfolgte unter Verwendung eines KLD-Enzymmix (NEB) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die GFP-Fusion zur erfolgreichen Strukturbestimmung hatte nach der TEV-Protease-Spaltung von MHNDKGEELF eine N-terminale Sequenz, wobei die MsbA-Sequenz unterstrichen war. Alle Plasmide wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die in dieser Studie verwendeten Primer finden Sie in der Quelldatendatei.

Die Wildtyp- und mutierten MsbA-Expressionsplasmide wurden in kompetente E. coli (DE3) BL21-AI-Zellen (Invitrogen) transformiert und bei 37 °C inkubiert, bis die OD600nm ≈ 0,6–1,0 betrug. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen mit Endkonzentrationen induziert 0,5 mM IPTG (Isopropyl-β-D-1-thiogalactopryanosid) und 0,2 % (w/v) Arabinose. Die Kulturen wurden über Nacht bei 25 °C induziert. Die Kulturen wurden dann 12 Minuten lang bei 4500 × g geerntet und das resultierende Pellet in 20 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 7,4 resuspendiert und mit Roche cOmplete Protease Inhibitor Cocktail-Tablette ergänzt. Die Suspension wurde in einem Mikrofluidizer M-110P von Microfluidics bei 25.000 psi auf Eis lysiert. Das Lysat wurde 20 Minuten lang bei 40.000 × g zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde 2 Stunden lang bei 100.000 × g zentrifugiert. Die resultierenden Pellets wurden gesammelt und in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 % (v/v) Glycerin, pH 7,4, homogenisiert. Die Membranlösung wurde mit 1 % (Gew./Vol.) DDM extrahiert und über Nacht bei 4 °C rotiert. Die Extraktion wurde dann 10 Minuten lang bei 40.000 × g zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde mit 10 mM Imidazol ergänzt und mit einem 0,45 µm Spritzenfilter filtriert.

Das extrahierte Material wurde einem umfassenden Detergens-Screening37 unterzogen, um die Delipidierungsfähigkeit jedes Detergens auf MsbA zu bestimmen. Kurz gesagt, His-markiertes MsbA wurde an 100 µL Ni-NTA-Perlen (Qiagen) gebunden, die mit NHA-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10 % (v/v) Glycerin, pH 7,4) ergänzt waren 2x die kritische Mizellenkonzentration (CMC) von DDM und dann mit 5 Säulenvolumina (CV) NHA, enthaltend 2x CMC DDM-Puffer, gewaschen. Das gebundene Protein wurde dann mit 10 CV NHA behandelt, das 2x CMC-DDM-Puffer enthielt, ergänzt mit 10x CMC verschiedener Detergenzien (Anatrace). Die Säule wurde dann mit 5 CV NHA-2x CMC DDM-Puffer erneut äquilibriert und mit 2 CV NHA, enthaltend 2x CMC DDM-Puffer, ergänzt mit 500 mM Imidazol, eluiert. Um den Grad der Delipidierung mittels nativer Massenspektrometrie zu überprüfen, wurde der Eluent über Micro Bio-Spin P-6-Gelzentrifugensäulen (Biorad) gemäß dem Protokoll des Herstellers in 200 mM Ammoniumacetat, 2x CMC DDM, pH 7,4 gepuffert. Nach der Bestimmung und Reinigung mit dem optimalen Waschmittel (NG) wurde das Protein auf einer HiPrep 26/10-Entsalzungssäule (GE Healthcare) zurück in NHA-2x CMC DDM gepuffert. Anschließend wurde die Probe über Nacht bei Raumtemperatur mit selbst hergestellter TEV-Protease behandelt, um den N-terminalen His-Tag zu entfernen. Während der TEV-Behandlung wurden 10 mM β-Mercaptoethanol zugesetzt. Das verdaute Material wurde über Ni-NTA-Agarose geleitet, die mit NHA-2x CMC DDM äquilibriert war, und der Durchfluss, der das gespaltene Material enthielt, wurde gesammelt. Das Material wurde unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators (Millipore, Molekulargewichtsgrenze 100 kDa) konzentriert, gefolgt von der Injektion auf eine Superdex 200 Erhöhung 10/300 GL-Säule (GE Healthcare), äquilibriert mit 20 mM HEPES, 200 mM NaCl, 10 % (v/v). ) Glycerin und 2x CMC C10E5. Peakfraktionen, die dimeres MsbA enthielten, wurden gepoolt und bei –80 °C schockgefroren.

Für MsbA mit reduzierter Kupfer(II)-Bindung wurde im Reinigungsschritt unter Verwendung von Ni-NTA-Perlen zusätzlich 1 mM MgCl2 zu allen Puffer- und MsbA-Lösungen hinzugefügt. Mit Kupfer(II) gesättigtes MsbA wurde durch Zugabe von 20 µM Kupfer(II)-Acetat und anschließendem Pufferaustausch mithilfe einer Bio-Spin-Säule erhalten, um überschüssiges Kupfer(II) zu entfernen. Durch Vanadat eingefangenes MsbA wurde durch Zugabe von ATP und MgCl2 zu MsbA erhalten, um die Endkonzentration von 10 mM für beide zu erreichen, und dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde Vanadat (pH 10) zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 37 °C. MsbA-Proben wurden mithilfe einer Bio-Spin-Säule gegen 200 mM Ammoniumacetat, ergänzt mit 2x CMC C10E5, für native MS-Studien gepuffert. Um MsbA-Proben für Kryo-EM-Studien vorzubereiten, wurden MsbA und eingefangenes MsbA mit Kupfer(II) vorbeladen und dann mit einer Superdex 200 Improve 10/300 GL-Größenausschlusssäule gereinigt, die mit 200 mM NaCl, 20 mM HEPES und 2x CMC C10E5 ohne Glycerin äquilibriert war. Peakfraktionen, die MsbA enthielten, wurden gepoolt und auf 8 mg/ml konzentriert und dann mit KDL im Molverhältnis 1:2 gemischt (1 KDL für 1 MsbA-Untereinheit).

Die Proben wurden in selbst hergestellte goldbeschichtete Glaskapillaren geladen37 und per Elektrospray in einen Thermo Scientific Exactive Plus Orbitrap mit erweitertem Massenbereich (EMR) ionisiert. Für die native Massenanalyse wurde das Instrument wie folgt eingestellt: Quell-DC-Offset von 25, Injektions-Flatapol-DC auf 8,0 V, Inter-Flatapol-Linse auf 7, gebogener Flatapol-DC auf 6,0, Transfer-Multipol-DC auf 2 und C-Falle-Eingangslinse auf 2. Einfanggasdruck auf 6,0 mit CID in der Quelle auf 60,0 eV und CE auf 100, Sprühspannung auf 1,70 kV, Kapillartemperatur auf 200 °C, maximale Injektionszeit auf 200 ms. Massenspektren wurden mit einer Auflösung von 17.500, Mikroscans von 1 und einer Mittelung von 100 erfasst.

Lipide wurden wie zuvor beschrieben hergestellt54, wobei in Chloroform gelöste Lipide unter einem Stickstoffstrom getrocknet und über Nacht unter Vakuum gesetzt und anschließend in Wasser gelöst wurden. Die Konzentration von MsbA wurde mithilfe eines DC-Protein-Assays (BioRad) mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. MsbA wurde mit Lipiden in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert und mit 200 mM Ammoniumacetat, ergänzt mit 2x CMC Lauryldimethylaminoxid (LDAO), im Volumenverhältnis 1:1 gemischt. Die Proben wurden eine Minute lang in der Nano-Elektrospray-Ionisationsquellenkammer inkubiert, um vor der Datenerfassung ein Gleichgewicht zu erreichen. Diese Proben wurden mit dem Orbitrap Exactive Plus EMR-Massenspektrometer (Thermo Scientific) analysiert, das mit den gleichen Einstellungen wie oben beschrieben betrieben wurde. Die Massenspektren für jedes Titrationsereignis wurden in dreifacher Ausfertigung erhalten. Die Massenspektren wurden mit UniDec55 entfaltet und die resultierenden Peakintensitäten für Apo und Lipid-gebundenes Protein bestimmt. Die relative Häufigkeit für jede Art wurde bestimmt, indem die Peakintensität durch die Gesamtintensität dividiert wurde, um sie für jedes unabhängige Experiment in Molenbruch umzuwandeln. Für die Bindung von MsbA (P) an das N-te Lipid (Ln) haben wir das folgende sequentielle Lipidbindungsmodell angewendet:

Wo:

Um den Stoffmengenanteil einer bestimmten Spezies zu berechnen54:

Für jedes Titriermittel in der Titration wurde die freie Lipidkonzentration wie folgt berechnet:

Das sequentielle Lipidbindungsmodell wurde durch Minimierung der Pseudo-\({\chi }^{2}\)-Funktion global an die Molenbruchdaten angepasst:

Dabei ist n die Anzahl der gebundenen Liganden und d die Anzahl der experimentellen Molenbruch-Datenpunkte.

Proben von MsbA wurden zur Elementaranalyse mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma an das Elementaranalyselabor der Texas A&M University geschickt. Es wurde ein NexION ICP-Massenspektrometer (PerkinElmer) mit den in der Ergänzungstabelle 2 angegebenen Betriebsparametern verwendet.

POPC (Avanti) wurde in Chloroform resuspendiert und unter einem Stickstoffgasstrom getrocknet. Der Film wurde mit Pentan gewaschen und erneut unter einem Stickstoffgasstrom getrocknet. Der Lipidfilm wurde über Nacht in einem Exsikkator gelagert und in Rehydrierungspuffer (20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM KCl) auf eine Endkonzentration von 20 mM rehydratisiert, gelegentlich eine Stunde lang gerührt und dann bei –80 °C gelagert. Die Liposomenmischung (~150 μl) wurde mit dem Rehydrierungspuffer auf die Hälfte verdünnt und mit einem Miniextruder (Avanti Polar Lipids) mit einer 100 nm Polycarbonatmembran extrudiert, bis die Lösung durchscheinend wurde. Die extrudierten Liposomen wurden dann in zwei verschiedene Portionen gleichen Volumens aufgeteilt: eine für das Wildtyp-Protein und eine für die Mutante. Die extrudierten Liposomen wurden dann mit einem gleichen Volumen Solubilisierungspuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl und 20 mM DDM) solubilisiert und 30 Minuten lang oder bis sie klar waren bei Raumtemperatur rotiert. Die MsbA-Proben wurden dann in einem Protein-Lipid-Verhältnis von 1:100 (Gew./Gew.) zugegeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur rotiert. Den Liposomen wurden BioBeads zugesetzt und über Nacht bei 4 °C rotiert, um das Detergenz zu entfernen.

Die ATPase-Aktivität von MsbA wurde nach einer modifizierten Version des Malachitgrün-Assays56 bestimmt. Für das vollständig delipidierte (Apo-)Protein wurden 400 nM MsbA (in 200 mM Ammoniumacetat, ergänzt mit 1x CMC C10E5 und 1x CMC LDAO) mit 5 mM MgCl2 und 200 μM ATP bei 37 °C 12 Minuten lang inkubiert. Zur Proteinanalyse mit KDL wurde der Probe Lipid in einer Endkonzentration von 5 µM zugesetzt. Endpunktproben wurden nach 3, 6, 9 und 12 Minuten gesammelt und durch Zugabe einer Malachitgrünlösung mit den folgenden Komponenten gestoppt: 3:1-Mischung aus 0,045 % (Gew./Vol.) Malachitgrün und 4,2 % (Gew./Vol.) Ammonium Molybdat, hergestellt in 4 N HCl, 0,04 % (v/v) Triton X-100 (Endkonzentration). Dann wurde 34 % (Gew./Vol.) Natriumcitrat zugegeben, um die Färbereaktion zu stoppen. Die gelöschten Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und die Absorption bei 650 nm wurde auf einem CLARIOstar-Plattenlesegerät (BMG LabTech) gemessen. Die Hydrolysegeschwindigkeit von ATP wurde durch Auftragen der Absorptionssteigung von Proben ermittelt, die nach 3, 6, 9 und 12 Minuten gesammelt wurden.

Erste Kristallisationsversuche wurden für das GFP-Fusionsprotein bei einer Konzentration von 1 mM (unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten bei 490 nm von 39,2 × 103 M−1 cm−1)52 unter Verwendung eines Mosquito LCP (TTP Labtech)-Kristallisationsroboters im hängenden Tropfen durchgeführt Platten bei 20 °C. Kristalle wuchsen im Indexzustand C5 (60 % Tacsimate pH 7,0) und wurden durch Erhöhung der Konzentration von Tacsimate pH 7,0 auf 70 % weiter optimiert. Die Kristalle wurden mit 100 % Tacsimate pH 7,0 kryogeschützt. Einkristalle wurden vor dem Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff mit CrystalCap HT Cryoloops (Hampton Research) montiert. Die ersten Beugungsdaten wurden intern auf einem Rigaku Raxis-IV++ gesammelt. Die Anfangsphasen wurden durch molekularen Ersatz mit dem PDB-Code 2B3P bestimmt. Die Modellverfeinerung und -erstellung erfolgte mit Phenix57 und Coot58. Anomale Daten wurden mit einer Wellenlänge von 1,378 Å an der Advanced Photon Source an der Strahllinie 24-ID-C gesammelt. Obwohl die Struktur durch SAD-Phaseneinstellung mit dem Phenix AutoSol-Programm bestimmt werden konnte, wurde das aus den internen Daten erstellte Modell für den molekularen Ersatz verwendet, gefolgt von der Modellerstellung und -verfeinerung.

Die Vitrifikation wurde mit einem Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher) durchgeführt, der bei 8 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit betrieben wurde. Insgesamt 3,5 μl Probe (8 mg/ml kupferbeladenes MsbA, entweder apo oder gefangen mit ADP-Vanadat in 200 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,4, ergänzt mit 2x CMC C10E5) wurden auf löchrige Kohlenstoffgitter (Quantifoil 300) aufgetragen Netz Cu 1,2/1,3) 30 s lang glimmentladen. Die Proben enthielten einen zweifachen molaren Überschuss an KDL. Die Gitter wurden 5 s lang bei Blotting-Stärke 1 unter Verwendung von Standard-Vitrobot-Filterpapier (Ted Pella, 47000-100) geblottet und dann in flüssiges Ethan getaucht.

Die optimierten Gitter wurden zur Datenerfassung an die Advanced Electron Microscopy Facility der University of Chicago geschickt. Der Datensatz wurde in Form von Filmstapeln mit einem Titan-Krios-Elektronenmikroskop bei 300 kV und einer K3-Direktdetektorkamera erfasst. Die Bilder wurden mit einer nominellen Vergrößerung von 81.000x im hochauflösenden Zählmodus durch Bildverschiebung aufgenommen. Die Gesamtbelichtungszeit wurde auf 4 s eingestellt, wobei alle 0,1 s ein Bild aufgezeichnet wurde, was zu 40 Bildern in einem einzelnen Stapel mit einer Gesamtbelichtung von etwa 50 Elektronen/Å2 führte. Der Defokusbereich wurde auf –1,0 bis –2,5 μm eingestellt. Einzelheiten zu den Datenerfassungsparametern finden Sie in der Ergänzungstabelle 8.

Die gesammelten Filme wurden einer Bewegungskorrektur durch MotionCor259 unterzogen. Die anschließende Verarbeitung erfolgte in cryoSPARC60. Der detaillierte Datenverarbeitungsablauf ist in der ergänzenden Abbildung 15 (mit Vanadat eingeschlossenes MsbA) und der ergänzenden Abbildung 22 (offenes, nach innen gerichtetes MsbA) dargestellt. Bühnendrift und anisotrope Bewegung der Stapelbilder wurden zunächst durch patchbasierte Bewegungskorrektur korrigiert. Die CTF-Parameter für jede mikroskopische Aufnahme wurden durch fleckenbasierte CTF-Schätzung bestimmt. Für Vanadat-gefangenes MsbA wurden die Partikel mithilfe der vom Blob-Picker generierten Vorlagen ausgewählt. Für die offene, nach innen gerichtete MsbA wurde der endgültige Partikelsatz mithilfe von Vorlagen ausgewählt, die aus einem 3D-Modell einer früheren Rekonstruktion generiert wurden. Für beide Datensätze wurden die Partikel durch zwei Runden der 2D-Klassifizierung bereinigt. Aus den verbleibenden Partikeln wurden mittels Ab-initio-Rekonstruktion drei erste Modelle generiert. Die Partikel wurden durch heterogene Verfeinerung basierend auf drei anfänglichen Modellen weiter klassifiziert. Für das Vanadat-eingefangene MsbA wurde die beste Partikelklasse für eine ungleichmäßige Verfeinerung mit Defokussierung pro Partikel und CTF-Optimierung ausgewählt und eine C2-Symmetrie auferlegt, was zu einer endgültigen Karte mit einer Auflösung von 3,6 Å führte. Für das offene MsbA wurde die beste Partikelklasse für eine ungleichmäßige Verfeinerung mit entweder C2- oder C1-Symmetrie ausgewählt, was zu endgültigen Karten mit einer Auflösung von 3,88 Å bzw. 4,06 Å führte. Einzelheiten zu den Bildverarbeitungsstatistiken finden Sie in der Ergänzungstabelle 8.

Die zuvor beschriebene Struktur17 von MsbA mit ADP-Vanadat aus Escherichia coli (PDB 5TTP) wurde mithilfe von Chimera61 an die Kryo-EM-Karte angedockt. Das Modell wurde manuell mit Coot58 verfeinert. Phenix57 wurde verwendet, um die Koordinaten- und Beschränkungsdateien für KDL zu generieren. Das endgültige Modell wurde mehreren Runden der Verfeinerung im realen Raum unter Verwendung von Phenix mit Sekundärstruktur und Ramachandran-Beschränkungen unterzogen. Geometrieausreißer wurden in Coot manuell korrigiert (nach jeder Runde). Die Statistiken der letzten Runde der Modellverfeinerung und der Modellgeometrie sind in der Ergänzungstabelle 9 aufgeführt. Die Zahlen wurden mit ChimeraX62 und Pymol (Schrödinger LLC., Version 2.1) erstellt. Einzelheiten zur Modellstatistik finden Sie in der Ergänzungstabelle 9.

Sequenzen für die Konservierungsanalyse wurden unter Verwendung von NCBI Blast und dem E. coli MSBA-Protein als Input gesammelt. Wir haben separat nach MSBA-Sequenzen von Gammaproteobakterien, Deltaproteobakterien, Alphaproteobakterien, Epsilonproteobakterien, der FCB-Klade und Bacilli gesucht, um eine breite Darstellung aller Bakterien zu erhalten. Anschließend haben wir die Sequenzen mit Muscle 3.83 abgeglichen. Wir haben alle Lücken, die durch fehlende Sequenzen in der E. coli-Sequenz verursacht wurden, entfernt und mithilfe eines benutzerdefinierten Python-Skripts Stellen extrahiert, die mit KDL in Kontakt stehen. Ein Subalignment, das nur diese Websites enthielt, wurde mit dem Weblogo-Server (https://weblogo.berkeley.edu/) verwendet, um das Sequenzlogo zu generieren. Zur Analyse der N-terminalen Sequenzen von ABC-Transportern wurden mehr als 20.000 MsbA-Sequenzen von UniProt heruntergeladen. Ein Python-Skript unter Verwendung von BioPython63 analysierte Sequenzen, die eine N-terminale Sequenz enthalten, die mit MH beginnt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für die Kristallstruktur eines N-terminalen Fragments von MsbA, das an GFP fusioniert und an Kupfer(II) gebunden ist, wurden in der Proteindatenbank (PDB) unter dem Zugangscode 8DHY (Kupfer(II)-gebundenes MsbA) hinterlegt N-terminales Peptid, fusioniert mit GFP). MsbA-KryoEM-Strukturen und -Karten wurden im PDB und EMDB wie folgt hinterlegt: 8DMO (offenes, nach innen gerichtetes MsbA) und EMD-27545 (offenes, nach innen gerichtetes MsbA); und 8DMM (Vanadat-gefangenes MsbA und an KDL gebunden) und EMD-27544 (Vanadat-gefangenes MsbA und an KDL gebunden). Zu den zuvor in dieser Studie verwendeten Proteinstrukturen gehören: 5TTP (verschlossenes, nach außen gerichtetes MsbA); 6BPP (MsbA im Komplex mit G092); 6BPL (MsbA im Komplex mit G907 und LPS); 7BCW (Vanadat-gefangenes MsbA); 6BL6 (offen, nach innen gerichtet Salmonella typhimurium MsbA); 3B60 (offener, nach außen gerichteter Salmonella typhimurium MsbA); und 2B3P (Superordner GFP). Native MS-Daten wurden bei Zenodo hinterlegt (https://doi.org/10.5281/zenodo.7268757). Diesem Dokument liegt eine Quelldatendatei bei. Weitere Daten zu diesem Manuskript sind auf Anfrage erhältlich.

Python-Code zur Bestimmung einzelner Gleichgewichtsbindungskonstanten ist unter https://github.com/LaganowskyLab verfügbar.

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Wir danken Bryan Tomlin vom Elemental Analysis Laboratory für die Elementaranalyse, Jonathan Schuermann und Igor Kourinov von APS für nützliche Diskussionen zur Datenerfassung. Wir danken auch Lauren Stover für die Hilfe bei der Vorbereitung des MsbA-Liposoms. Ein Teil dieser Arbeit basiert auf Forschungsarbeiten, die an den Strahllinien des Northeastern Collaborative Access Team (P30 GM124165) an der Advanced Photon Source (DE-AC02-06CH11357) durchgeführt wurden. Diese Arbeit wurde auch von den National Institutes of Health (NIH) unter den Fördernummern (DP2GM123486, R01GM121751, R01GM139876, R01GM138863 und RM1GM145416 an AL; R35GM143052 an MZ und P41GM128577 an DR) und der Max-Planck-Gesellschaft an GKAH unterstützt. Wir danken den Mitarbeitern der University of Chicago Advanced Electron Microscopy (RRID:SCR_019198) für die Hilfe bei der Kryo-EM-Datenerfassung. Wir danken dem Research Computing Center der University of Chicago für die Unterstützung dieser Arbeit durch die Bereitstellung der Rechenressourcen des vom NIH finanzierten Beagle3 HPC-Clusters (S10OD028655).

Charles Packianathan

Aktuelle Adresse: Walter Reed Army Institute of Research, Pilot Bioproduktionsanlage, Silver Spring, 20910, MD, USA

Fakultät für Chemie, Texas A&M University, College Station, 77843, TX, USA

Jixing Lyu, Tianqi Zhang, Samantha Schrecke, Nicklaus P. Elam, Charles Packianathan, David Russell und Arthur Laganowsky

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, University of Chicago, Chicago, 60637, IL, USA

Chang Liu & Minglei Zhao

Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie und Fachbereich Chemie, Universität Marburg, Marburg, Deutschland

Georg KA Hochberg

Zentrum für Synthetische Mikrobiologie (SYNMIKRO), Fachbereich Chemie, Universität Marburg, Marburg, Deutschland

Georg KA Hochberg

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JL und AL haben die Forschung entworfen. JL, TZ, NE und CP exprimierten und reinigten MsbA. JL führte massenspektrometrische Experimente durch. JL und TZ führten die Funktionstests durch. JL, MZ, DR und AL analysierten die Daten. CL und MZ sammelten und verarbeiteten Kryo-EM-Daten. SS, JL, TZ und AL führten eine Röntgenkristallographie durch. SS, CL, JL, MZ und AL bauten die Atommodelle. GH und AL analysierten MsbA-Sequenzen. JL und AL haben das Manuskript mit Hilfe der anderen Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Arthur Laganowsky.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Antonio Calabrese, Erik Yukl und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lyu, J., Liu, C., Zhang, T. et al. Strukturelle Grundlage für die Lipid- und Kupferregulation des ABC-Transporters MsbA. Nat Commun 13, 7291 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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Eingegangen: 01. August 2022

Angenommen: 10. November 2022

Veröffentlicht: 26. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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