ERK1/2 ist ein uraltes Organisationssignal bei der Spiralspaltung

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2286 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Tierentwicklung wird als bedingt oder autonom klassifiziert, je nachdem, ob das Zellschicksal durch induktive Signale bzw. mütterliche Determinanten festgelegt wird. Dennoch bleibt unklar, wie sich diese beiden Hauptentwicklungsmodi entwickelt haben. Während der Spiralspaltung – einer stereotypischen Embryogenese, die in 15 Wirbellosengruppen, einschließlich Weichtieren und Ringelwürmern, vorkommt – geben die meisten Abstammungslinien das Zellschicksal bedingt an, während einige das primäre axiale Schicksal autonom definieren. Um die Mechanismen zu identifizieren, die diese Veränderung vorantreiben, untersuchen wir Owenia fusiformis, einen früh verzweigten, bedingten Ringelwürmer. Bei Owenia spezifiziert die ERK1/2-vermittelte FGF-Rezeptorsignalisierung den endomesodermalen Vorläufer. Diese Zelle fungiert wahrscheinlich als Organisator, indem sie mesodermale und posterodorsale Schicksale in benachbarten Zellen induziert und anteriorisierende Signale unterdrückt. Die organisierende Rolle von ERK1/2 in Owenia wird mit Mollusken geteilt, nicht jedoch mit autonomen Ringelwürmern. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die bedingte Spezifikation eines ERK1/2+-Embryonalorganisators ein Vorläufer der Spiralspaltung ist und in Ringelblumenlinien mit autonomer Entwicklung wiederholt verloren ging.

Die Bindung der ersten embryonalen Zellen an eingeschränktere Entwicklungsschicksale (z. B. Endoderm, Neuroektoderm und Mesoderm) ist ein entscheidender Schritt in der tierischen Embryogenese, der zur Festlegung von Körperplänen führt und die nachfolgende Entwicklung beeinflusst1,2,3. Um diese frühe räumliche Organisation zu definieren, kombinieren tierische Embryonen bedingte, induktive Zell-Zell-Interaktionen mit der asymmetrischen Vererbung zellautonomer mütterlicher Determinanten1,2,4. Häufig ist eine dieser Entwicklungsstrategien vorherrschend und daher wird die Embryogenese von Tieren entweder als bedingt oder autonom definiert1,2,4. Im Laufe der Evolution sind die Abstammungslinien der Tiere zwischen diesen beiden Hauptmodi der Bestimmung des Zellschicksals übergegangen5. Es ist jedoch unklar, wie diese Entwicklungsübergänge ablaufen, da sie oft mit zusätzlichen Variationen in der frühen Embryogenese (z. B. in den Spaltungsmustern6,7) einhergehen, was es schwierig macht, die Ursachen für Verschiebungen der Zellschicksalspezifikationen zu identifizieren.

Die Spiralspaltung ist ein uraltes und stereotypisches frühes Entwicklungsprogramm, das durch abwechselnde schräge Zellteilungen ab dem 4-Zellen-Stadium gekennzeichnet ist und bei Wirbellosengruppen innerhalb von Spiralia, einschließlich Weichtieren und Ringelwürmern, vorkommt8,9 (Abb. 1a). Spiralspaltende Embryonen organisieren das Zellschicksal um vier embryonale Quadranten – A–D genannt –, die in etwa der linken, ventralen, rechten bzw. dorsalen Körperseite entsprechen8,9. Obwohl die Spiralspaltung oft als Lehrbuchbeispiel für autonome Entwicklung dargestellt wird2,4, spezifizieren spiralspaltende Embryonen ihre axiale Identität entweder bedingt oder autonom, ohne dass dies Auswirkungen auf die allgemeine Erhaltung des Spaltungsprogramms und der embryonalen Zelllinien hat8,9,10 (Abb. 1b). Im bedingten Modus der Zellschicksalspezifizierung überweisen induktive Signale zwischen den Zellen im Tierpol und einem pflanzlichen Blastomer im Stadium von ca. 32–64 Zellen letzteres dem dorsalen D-Schicksal11. Diese Zelle fungiert als embryonaler Organisator, weist benachbarte Zellen auf bestimmte Schicksale hin und erstellt den tierischen Körperplan (Abb. 1b). Diese Art der Spiralspaltung ist weit verbreitet und stammt höchstwahrscheinlich von Spiralia ab11,12,13 (siehe Dohle für eine alternative Hypothese14) (Abb. 1c). Einige Abstammungslinien von Mollusken und Ringelwürmern11,12 spezifizieren jedoch die axialen Identitäten durch die asymmetrische Aufteilung der mütterlichen Determinanten auf ein Blastomer im Embryo im 4-Zellen-Stadium15,16,17 (Abb. 1b). Dieses Blastomer wird das dorsale D-Schicksal übernehmen und einer seiner Nachkommen wird anschließend als embryonaler Organisator fungieren. Daher ist das Vorhandensein sowohl bedingter als auch autonomer Entwicklungsmodi bei spiralspaltenden Tieren12 ein ideales System zur Identifizierung der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Übergängen der Zellschicksalspezifikationen in tierischen Embryonen zugrunde liegen. Dennoch sind die Mechanismen, die die Spiralspaltung regulieren, und damit auch die Schalter im Entwicklungsmodus, kaum verstanden.

a Spiralspaltung ist ein stereotyper Entwicklungsmodus, der auf Spiralia (z. B. Schnecken und segmentierte Würmer) zurückgeht, einer der drei Hauptlinien bilateral symmetrischer Tiere (Bilateria). Die Spiralspaltung ist durch abwechselnde schräge Zellteilungen (rote Pfeile) entlang der tierischen Pflanzenachse ab dem 4-Zellen-Stadium gekennzeichnet. b Spiralspaltende Embryonen legen ihre axiale Identität und ihren embryonalen Organisator entweder bedingt oder autonom fest. Im bedingten Modus erfolgt die Spezifikation der posterodorsalen Identität (D-Quadrant; dargestellt als D) und des embryonalen Organisators spät in der Spaltung (~32–64 Zellstadien, je nach Art) durch induktive Signale. Der autonome Modus der Bestimmung des Zellschicksals beruht jedoch auf unterschiedlich getrennten mütterlichen Faktoren (rote Punkte), die den D-Quadranten bereits im 4-Zellen-Stadium (Zelle mit D) spezifizieren. Später während der Spaltung wird eine Zelle des D-Quadranten, die vermutlich einen Teil dieser mütterlichen Faktoren erbt, als embryonaler Organisator fungieren. c Der bedingte Modus findet sich in allen Spirallinien, die eine Spiralspaltung aufweisen, und der autonome Modus wird nur bei Mollusca und Annelida beobachtet, was darauf hindeutet, dass die bedingte Spezifikation uralt ist. Während konditionale und autonome Mollusken die MAP-Kinase ERK1/2 verwenden, um ihren Körperplan zu erstellen, sind alle untersuchten autonomen Ringelwürmer nicht auf diese Signalkaskade angewiesen und es liegen keine Kenntnisse außerhalb von Mollusca und Annelida vor. Die ursprünglichen Mechanismen, die die Spiralspaltung steuern, sind daher noch unbekannt, was unser Verständnis der Evolution von Spiralia einschränkt. Der bedingte Ringelwürmer Owenia fusiformis kann als Mitglied der Schwesterlinie aller verbleibenden Ringelwürmer dabei helfen, auf die Entwicklungsmerkmale der Vorfahren von Annelida und Spiralia als Ganzes zu schließen. Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu.

Der ERK1/2-Signalweg – eine evolutionär konservierte intrazelluläre Kaskade von Kinasen 18 – spezifiziert die Identität des dorsalen D-Quadranten und steuert die Organisationsaktivität in Mollusca (Abb. 1c; Ergänzungstabelle 1). In vielen konditionierten Mollusken aktivieren induktive Wechselwirkungen ERK1/2 im Blastomer, das das dorsale D-Schicksal übernimmt und als embryonaler Organisator fungiert19,20,21,22,23, obwohl die Abstammungsidentität dieser Zelle je nach Art unterschiedlich ist (Ergänzungstabelle 1). Ebenso ist aktives diphosphoryliertes ERK1/2 im D-Quadranten-Blastomer erforderlich, das als embryonaler Organisator24 in der ansonsten autonomen Molluske Tritia obsoleta17 fungiert. Bei Annelida weisen autonome Arten jedoch unterschiedliche Muster der ERK1/2-Aktivität auf und benötigen diesen Signalweg nicht, um den dorsalen D-Quadranten und den embryonalen Organisator zu spezifizieren (Abb. 1c; Ergänzungstabelle 1). Die Rolle von ERK1/2 bei der Spiralspaltung ist jedoch sowohl für bedingte Ringelwürmer als auch für die meisten anderen Spiralgruppen unbekannt (Abb. 1c). Dies verhindert den Rückschluss auf die Mechanismen der Vorfahren, die die Körperstrukturierung in Annelida und Spiralia im Allgemeinen steuern (Abb. 1c), und daher ist nicht bekannt, ob die axiale Organisationsrolle von ERK1/2 eine Molluskeninnovation oder ein Mechanismus zur Spezifizierung des Schicksals der Vorfahrenzellen ist, der in einigen autonomen Zellen verloren gegangen ist Abstammungslinien der Ringelwürmer.

In dieser Arbeit haben wir die Art Owenia fusiformis29,30 strategisch untersucht, um die Rolle der ERK1/2-Signalübertragung in einem bedingten Ringelwürmer zu bestimmen (Abb. 1c). Diese Meeresart gehört zu Oweniida – der Schwestergruppe aller übrigen Ringelwürmer31,32 – und weist embryonale Merkmale auf, die als Vorfahren von Annelida gelten30,33. Daher kann die Untersuchung von O. fusiformis im Vergleich mit anderen Ringelwürmer- und Spirallinienlinien dazu beitragen, Abstammungsmerkmale dieser Gruppe und von Spiralia im Allgemeinen abzuleiten.

Im Gegensatz zu Arten mit autonomem Entwicklungsmodus, bei denen das Blastomer der D-Linie, die mütterliche Determinanten erbt, größer ist, sind die vier embryonalen Quadranten in Embryonen mit dem bedingten Modus der Spiralspaltung symmetrisch, was den Rückschluss auf Zellidentitäten während der frühen Entwicklung erschwert. Die Zelle, die im D-Quadranten als embryonaler Organisator fungiert, verzögert jedoch das Fortschreiten des Zellzyklus im Vergleich zu entsprechenden Blastomeren im A-C-Quadranten und weist in einigen konditionierten Mollusken eine Anreicherung von aktivem (d. h. diphosphoryliertem) ERK1/2 auf10,20 und vermutlich der bedingte Ringelwurm Hydroides hexagonus20 (Abb. 1c). Um die D-Linie zu bestimmen und einen potenziellen embryonalen Organisator in O. fusiformis zu identifizieren, haben wir daher zunächst die Zellteilungsdynamik und die Muster der ERK1/2-Aktivität im vegetativen Pol von der Befruchtung bis zum Beginn der Gastrulation (6 Stunden nach der Befruchtung, HPF) charakterisiert ). Bei dieser Ringelblume tritt die erste Spaltungsasymmetrie mit dem Auftreten des vierten Mikromerquartetts (4q-Zellen) bei ~ 4 hpf auf, wenn sich vor den beiden anderen ein Paar 4q-Zellen bildet (ergänzende Abbildung 1a, b). Dennoch bleibt der Pflanzenpol symmetrisch und embryonale Quadrantenidentitäten sind bei 5 hpf (Coeloblastula-Stadium; ergänzende Abbildung 1c) nicht erkennbar. Mit Beginn der Gastrulation bei 6 hpf30 teilen sich jedoch alle bis auf eines der 4q-Blastomeren (ergänzende Abbildung 1d). Die ungeteilte 4q-Zelle ist in diesem Stadium größer und spaltet sich erst nach dem Eindringen während der frühen Gastrulation bei 7 hpf in zwei große Zellen auf (ergänzende Abbildung 1e, f). Daher tritt das früheste morphologische Zeichen einer bilateralen Symmetrie bei O. fusiformis mit der Bildung und verzögerten Teilung eines 4q-Mikromers auf, bei dem es sich vermutlich um die 4d-Zelle in anderen bedingten Ringelwürmern mit ähnlicher Teilungs- und Eindringungsdynamik der 4q-Blastomere handelt34,35 ,36,37.

Um die Muster der ERK1/2-Aktivität und ihre Verbindung zu den 4q-Mikromeren in O. fusiformis zu analysieren, verwendeten wir einen kreuzreaktiven Antikörper gegen die aktive diphosphorylierte Form von ERK1/2 (di-P-ERK1/2)20. 24 von der Befruchtung bis zum Beginn der bilateralen Symmetrie und dem ungeteilten 4q-Mikromer (6 hpf). Dieses Annelid hat ein einzelnes ERK1/2-Ortholog, das in aktiven Eizellen in geringen Mengen und bis zu 4 hpf (~32 Zellstadium) exprimiert wird, wenn seine Expression und Aktivität zunimmt (ergänzende Abbildung 2a – d). Zu diesem Zeitpunkt weisen die vier tierischsten/apikalsten Mikromere ein angereichertes di-P-ERK1/2-Signal auf (Abb. 2a, b; ergänzende Abb. 2c), das bei 5 hpf verschwindet, wenn di-P-ERK angereichert ist Stattdessen ein 4q-Mikromer (Abb. 2c, d; ergänzende Abb. 2c). Bei 6 hpf wird das di-P-ERK1/2-Signal in sieben Blastomeren angereichert, darunter drei Mikromerpaare des zweiten Quartetts und des 4q-Mikromers, das die quadriradiale Symmetrie des Embryos durch Aufschieben der Spaltung auf 7 hpf aufbricht (Abb. 2e, f; Ergänzende Abb. 2c). Zusammengenommen belegen unsere Daten, dass das di-P-ERK1/2 4q-Mikromere bei 5 und 6 hpf in O. fusiformis anreichert und die Spaltung verzögert, bis 7 hpf die 4d-Zelle ist (Abb. 2g), was dem im Anneliden beobachteten Zustand ähnelt H. hexagonus20 und viele Schneckenmollusken19,20,21,22,24.

a–f Z-Stapelprojektionen von Embryonen im Ganzkörperstadium 4, 5 und 6 Stunden nach der Befruchtung (hpf), gefärbt gegen aktives diphosporyliertes ERK1/2 (di-P-ERK1/2; gelb) und Kerne (DAPI). Bei 4 hpf (a, b) ist di-P-ERK1/2 in vier tierischen Zellen (1q111) angereichert. Bei 5 hpf (c, d) befindet sich das di-P-ERK1/2-Signal in einer einzelnen Zelle (dem 4d-Mikromer; siehe ergänzende Abbildung 1), während aktives ERK1/2 in sechs Zellen der 2a-c-Linie auftritt die 4d-Zelle bei 6 hpf (e, f). Die Einfügungen in a–f sind Hellfeldbilder der entsprechenden Stapel. g Schematische Darstellung des vegetativen Pols während der Geburt und der ersten Teilung des vierten Mikromerquartetts bei O. fusiformis. In Rot angereichertes di-P-ERK1/2-Signal. In d und f zeigen die Sternchen auf den Tierpol. Beschreibungen für a–f basieren auf mindestens zehn Embryonen pro Stadium aus mindestens zwei biologischen Replikaten. Maßstabsbalken sind 50 μm. Zeichnungen in g sind nicht maßstabsgetreu.

Um die Rolle des ERK1/2-Signals während der Entwicklung von O. fusiformis weiter zu untersuchen, behandelten wir Embryonen mit Brefeldin A (BFA), einem Inhibitor des intrazellulären Proteintransports, der zuvor verwendet wurde, um die Induktion des Organizers in anderen spiralspaltenden Embryonen zu blockieren;29, 38 und U0126, ein selektiver Inhibitor der MEK1/2- und ERK1/2-Diphosphorylierung24,39 (Abb. 3a). Bei beiden Arzneimitteln blockiert die Behandlung von der Befruchtung (~ 0,5 hpf) bis 5 hpf, wenn di-P-ERK1/2 in 4d angereichert ist, wirksam die Aktivierung von ERK1/2 (Abb. 3b; ergänzende Abb. 3a; ergänzende Tabelle 2). und verursacht dosisabhängig den Verlust der bilateralen Symmetrie, der hinteren Strukturen (z. B. Chaetae und Hinterdarm) und der Larvenmuskulatur bei bis zu 100 % der Embryonen bei einer Konzentration von 10 µM (Abb. 3c; ergänzende Abb. 3b; ergänzende Tabellen). 3 und 4). Im Vergleich zu Kontrollproben fehlt bei mit 0,5–5 HPF behandelten Embryonen ein vollständig ausgebildetes Apikalbüschel und Apikalorgan, was eine verringerte ektodermale Expression des Apikalorganmarkers Six3/6 und weniger Apikalzellen zeigt, die positiv für den neuronalen Marker Synaptotagmin-1 (syt1) sind30 ( Abb. 3d). Darüber hinaus fehlt den behandelten Embryonen die Expression von mesodermalen Markern für den Hinterdarm (cdx) und den Rumpf (Twist)3, sie zeigen eine erweiterte Expression des oralen ektodermalen Markergens gsc3 um die einzelne Darmöffnung (Abb. 3d; ergänzende Abb. 3c) und behalten die Expression bei der endodermale Mitteldarmmarker GATA4/5/6b3 (ergänzende Abbildung 3c). Wir betrachten diesen Phänotyp als anteroventral radialisiert (oder radial; Ergänzungstabelle 3). Daher ist die Aktivierung des ERK1/2-Signals in der 4d-Zelle im Coeloblastula-Stadium erforderlich, um während der Embryogenese von O. fusiformis hintere und dorsale Strukturen zu spezifizieren und zu entwickeln, obwohl auch die Hemmung der ERK1/2-Aktivität im 1q111 (bei 4 hpf) dazu beitragen könnte zum reduzierten apikalen Organphänotyp.

a Schematische Darstellung der ERK1/2-Signalkaskade und Wirkungsweise von Brefeldin A (BFA) und U0126. b Gesamtpräparat-Immunfärbung gegen di-P-ERK1/2 (Haupttafeln sind Seitenansichten; Einschübe sind Pflanzenansichten). BFA- und U0126-Behandlungen 0,5 h nach der Befruchtung (hpf) bis 5 hpf verhindern die Anreicherung von di-P-ERK1/2 in der 4d-Zelle. c Seitliche Z-Stapel-Projektionen der Kontrolle und BFA/U0126 24-hpf-Larven, behandelt mit 0,5–5 hpf. Bei den behandelten Embryonen handelt es sich um ventrale Ansichten. Zilien werden mit antiacetyliertem Tubulin und F-Aktin mit Phalloidin markiert. d Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung auf Kontroll- und U0126-behandelten (0,5–5 hpf) Larven. e Schematische Darstellung der analysierten Arzneimittelbehandlungsfenster. Die Anzahl der Fälle wird rechts neben jedem Balken angezeigt und gibt das Zeitintervall an. f Verteilung und Prozentsätze der beobachteten Larvenphänotypen für jedes Fenster und jede Versuchsbedingung (WT, Wildtyp; R, radial). g Phänotypische Charakterisierung des komprimierten Larvenphänotyps, der nach BFA-Behandlung von 0,5 hpf bis 3–4 hpf erhalten wurde. Erste Reihe, seitliche Z-Stapel-Projektionen von Larven, gefärbt mit DAPI (Kerne), Phalloidin (F-Aktin) und acetyliertem Tubulin (Zilien). Untere Reihen, Seitenansichten der In-situ-Hybridisierung des gesamten Reittiers gegen apikale ektodermale (six3/6), orale ektodermale (gsc), Hinterdarm- (cdx) und mesodermale (Twist) Marker. Komprimierte Larven sind normal, haben aber ein reduziertes apikales Organ und ihre Larvenblastozele ist irgendwie ausgelöscht. In b–d und g zeigen Sternchen auf den apikalen Pol. Für b enthält die Ergänzungstabelle 2 detaillierte Zahlen. Für c–d und g gibt Supplementary Data 1 detaillierte Zahlen an. Für e und f enthält die Ergänzungstabelle 5 detaillierte Zahlen. Schematische Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu. ao apikales Organ, Anus, ch Chaetae, mg Mitteldarm, mo Mund, pt Prototroch. Maßstabsbalken sind 50 μm.

Um den genauen Zeitpunkt der Induktion und Aktivität von ERK1/2 während der O. fusiformis-Spaltung zu ermitteln, behandelten wir Embryonen mit 10 µM BFA/U0126 in überlappenden Zeitfenstern von der Befruchtung bis zur frühen Gastrulation (Abb. 3e, f; Ergänzungstabelle 5). Die Blockierung der Proteinsekretion mit BFA von der Befruchtung bis zum 8-Zellen-Stadium hat keinen Einfluss auf die normale Entwicklung. Allerdings führt eine BFA-Behandlung zwischen dem 8-Zellen-Stadium und 4 HPF zu Larven mit allen morphologischen Merkmalen einer typischen Mitraria-Larve und normaler Expression gewebespezifischer Marker, jedoch mit einer komprimierten Morphologie entlang der apikal-ventralen Achse, möglicherweise aufgrund einer beeinträchtigte Bildung der Larvenblastozele (Abb. 3g; ergänzende Abb. 3c). Nur die Behandlung mit BFA von 4–6 hpf und somit die Bildung von 4d umfasst einen radialen Phänotyp, wobei Behandlungen nach 5 hpf tödlich sind (Abb. 3e, f; ergänzende Abb. 3c). All dies deutet darauf hin, dass ein potenzielles induktives Ereignis, das die Aktivierung von ERK1/2 in 4d antreibt, zwischen 4 und 5 hpf direkt während der 4q-Mikromerbildung stattfinden sollte (ergänzende Abbildung 1a – c). Unerwarteterweise führt die Verhinderung der ERK1/2-Diphosphorylierung mit U0126 vom 2-Zellen-Stadium bis 4 hpf, wenn dieses Induktionsereignis beginnen könnte, auch zu einem radialen Phänotyp (Abb. 3e) mit nur geringfügigen Unterschieden zwischen bestimmten Zeitpunkten (ergänzende Abb . 2c). Daher ist die ERK1/2-Aktivität für die normale embryonale Strukturierung und posterodorsale Entwicklung während der meisten Spiralspaltungen bei O. fusiformis von wesentlicher Bedeutung. Die Kombination der BFA- und U0126-Phänotypen legt jedoch nahe, dass ERK1/2 vom 2-Zellen-Stadium bis zum 4-hpf-Stadium autonom agieren könnte, während es für seine Funktion einen intrazellulären Proteintransport – und damit möglicherweise induktive Zell-zu-Zell-Kommunikationssignale – erfordert Bereicherung in 4d.

Um die Mechanismen zu untersuchen, durch die ERK1/2 die posterodorsale Entwicklung bei O. fusiformis steuert, stellten wir als nächstes die Hypothese auf, dass eine genomweite Profilierung der Genexpression in mit BFA und U0126 behandelten Embryonen vorgelagerte Regulatoren und nachgelagerte Ziele der ERK1/2-Aktivität aufdecken würde. Daher behandelten wir Embryonen entweder mit 10 µM BFA oder 10 µM U0126 von der Befruchtung bis 5 hpf (um sowohl die autonome als auch die bedingte Phase der ERK1/2-Aktivität abzudecken) und führten ein RNA-seq-Transkriptom-Profiling in behandelten und kontrollierten Embryonen durch, die direkt nach der Di- P-ERK1/2-Anreicherung in der 4d-Zelle (Coeloblastula; 5,5 hpf) und im Larvenstadium (Abb. 4a; ergänzende Abb. 4a, b). Differenzielle Expressionsanalysen ergaben 90 bzw. 268 differenziell exprimierte Gene (DEGs; log2 (Fold Change) < –1,5 und an die Rate der falschen Entdeckung angepasster p-Wert < 0,05) in BFA-behandelten Coeloblastulae bzw. Larven und 132 (Coeloblastula) bzw. 373 (Larve) DEGs nach U0126-Behandlung (Abb. 4b). Bei der Berücksichtigung aller Vergleiche und der Beseitigung von Redundanzen haben wir insgesamt 628 DEGs entdeckt, von denen 414 (65, 92 %) funktionell annotiert und mit genontologischen Begriffen im Zusammenhang mit der Regulierung der Transkription, Entwicklung und Spezifikation des Zellschicksals angereichert waren (Ergänzungsdaten 2). Die meisten dieser DEGs waren herunterreguliert (Abb. 4b, c; ergänzende Abb. 4c, d), und nur drei DEGs (cdx, fer3 und foxH) schienen in beiden Arzneimitteln und zu den beiden Entwicklungszeitpunkten systematisch herunterreguliert zu sein (Abb. 4b; ergänzende Abb. 4b). Abb. 4d). Bemerkenswerterweise zeigten U0126- und BFA-Downstream-Ziele eine begrenzte Überlappung (ergänzende Abbildung 4d), was wahrscheinlich auf die unterschiedliche Spezifität der beiden Behandlungen zurückzuführen ist, wobei BFA weitgehend auf den intrazellulären Transport und die Proteinsekretion abzielt und daher möglicherweise mehr Off-Target-Effekte zeigt als U0126. Dennoch ergab unser Ansatz einen sicheren und relativ kleinen Satz von Genen, deren Expression stark von der ERK1/2-Aktivität abhängt.

a Experimentelles Design für RNA-seq-Sammlungen. Einfarbige Balken zeigen den Kontrollzeitraum (DMSO), Brefeldin A (BFA) und U0126-Behandlungen. Rote Kreise zeigen die Probenentnahme an der Coeloblastula (5,5 Stunden nach der Befruchtung, HPF) und im Larvenstadium (24 HPF). b Anzahl der differentiell exprimierten (DE) Gene unter verschiedenen Bedingungen und Vergleichen (angezeigt durch weiße und graue Punkte unten; graue Punkte markieren die im Vergleich einbezogenen Bedingungen), wobei rote Balken herunterregulierte Gene und blaue Balken hochregulierte Gene darstellen. c Vulkandiagramme (zweiseitiger Wald-Test) für mit BFA und U0126 behandelte Coeloblastula. Rote Punkte zeigen DE-Gene, wobei die Kandidatengene für jeden Vergleich gekennzeichnet sind. d Zeitlicher und räumlicher zeitlicher Verlauf der Expression von Kandidatengenen, die von einer 4d-Fehlspezifikation betroffen sind und im Allgemeinen mit der Entwicklung von Apikal/Anterior, Chaetae/Posterior, Hinterdarm und Mesoderm verbunden sind. Die erste Spalte („Zustand“) gibt die Behandlung (BFA oder U0126) und das Entwicklungsstadium (CB coeloblastula, L-Larve) an, in dem jedes der Kandidatengene unterschiedlich exprimiert wird (jeder Zustand wird mit einer anderen Farbe hervorgehoben). Die zentrale Heatmap zeigt normalisierte Z-Score-Expressionswerte für jedes Gen. Die vertikale gepunktete Linie verdeutlicht den Zeitpunkt der 4D-Spezifikation. Die dritte Spalte zeigt vollständige In-situ-Hybridisierungsbilder einer Untergruppe dieser 22 Kandidatengene im Coeloblastula- (5 hpf), Gastrula- (9 hpf) und Larvenstadium (24 hpf). e Nur drei der Kandidatengene (cdx, foxH und fer3) werden in allen Stadien und Behandlungsvergleichen herunterreguliert. Die Validierung mittels In-situ-Hybridisierung zeigt, dass die Expression dieser Gene nach der medikamentösen Behandlung verloren geht. In d und e sind die Bilder für CDX im Coeloblastula- und Larvenstadium, Kontrollbedingung, gleich. In d und e zeigen Sternchen auf den tierischen/apikalen Pol und Pfeilspitzen auf die Ausdrucksdomänen. In-d-Heatmaps wurden aus einem Entwicklungszeitverlauf erstellt, der aus zwei biologischen Replikaten generiert wurde, und die In-situ-Expression erfolgte mit mindestens zwei biologischen Replikaten. Für c und e gibt Supplementary Data 1 detaillierte Zahlen an. Maßstabsbalken sind 50 μm. Schematische Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu. bp Blastoporus, mo Mund.

Um zu bestätigen, dass die DEGs von einer 4d-Fehlspezifikation betroffen sind, haben wir 22 DEGs für weitere Genexpressionsanalysen ausgewählt (Abb. 4d; Ergänzungstabelle 6), einschließlich einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren, die Marker für bestimmte Zellen und Gewebetypen sind (z. B. six3/ 6, gsc, cdx, AP2, foxQ2), erforderlich für die Mesodermentwicklung (z. B. Twist, Hand2, FoxH) und Neurogenese (z. B. POU4, irxA), Wnt-Liganden (wnt1, wntA und wnt4), TGF-β-Modulatoren (noggin und BAMBI) und Notch-Signalisierungskomponenten (delta- und kerbartig). Stadienspezifische RNA-seq-Daten, die 12 Entwicklungszeitpunkte33 abdecken, von der unbefruchteten Eizelle bis zur reifen Larve, bestätigten, dass die Expression aller Kandidatengene zum Zeitpunkt oder kurz nach der 4-Tage-Spezifikation und der di-P-ERK1/2-Anreicherung hochreguliert wird in dieser Zelle (Abb. 4d). Diese Gene werden entweder in apikalen/anterioren Domänen (Noggin, BAMBI, foxQ2, POU4, six3/6, gsc), der hinteren Larvenspitze und Chaetae (fer3, lhx1/5, wnt1, notch, msx2-a, irxA, AP2) exprimiert , wnt4, delta), der Hinterdarm (cdx) oder mesodermale Derivate (foxH, rhox, wntA, POU3, hand2, Twist) (Abb. 4d; ergänzende Abb. 5a – g). Die Analyse der Expression dieser Gene in Kontrollembryonen und behandelten Embryonen im Coeloblastula- (5,5 hpf) und Larvenstadium (24 hpf) bestätigte, dass die Expressionsdomänen dieser Gene nach der Behandlung mit BFA oder U0126 verschwinden (Abb. 4e; ergänzende Abb. 5a). –g; Ergänzende Daten 1; Ergänzende Tabelle 7), wodurch unser RNA-seq-Ansatz validiert wird. Insgesamt decken unsere Ergebnisse eine Reihe koregulierter Gene auf, die stromabwärts der ERK1/2-Signalisierung wirken und an der Entwicklung apikaler, posterodorsaler und mesodermaler Strukturen in O. fusiformis beteiligt sind.

Unsere RNA-seq-Studie und das Kandidatengen-Screening ergaben neun Gene, die am pflanzlichen Pol bei 5,5 hpf exprimiert wurden und deren Expression durch eine direkte Hemmung der ERK1/2-Diphosphorylierung (cdx, delta, foxH, wnt1, wntA, rhox, fer3) beeinflusst wurde und AP2) oder die den intrazellulären Proteinhandel und die intrazelluläre Proteinsekretion beeinträchtigen (Abb. 4e; ergänzende Abb. 5a, c, e). Keines dieser Gene wird bei 5 hpf zum Beginn der ERK1/2-Aktivität im 4d-Mikromer exprimiert (Abb. 5a). Stattdessen wird der frühe endodermale Marker GATA4/5/6a3, dessen Expression durch die Behandlung mit BFA und U0126 nicht beeinflusst wird, in diesem Stadium symmetrisch in der Magenplatte (einschließlich 4d) exprimiert (Abb. 5a; ergänzende Abb. 6a). Bei 5,5 hpf, eine halbe Stunde nach der ersten Aktivierung des ERK1/2-Signals in 4d, wird der vegetative Pol bilateral symmetrisch gemustert, aber nur zwei der ERK1/2-abhängigen Gene (cdx und delta) werden im 4d-Mikromer exprimiert (Abb . 5b, c). Bemerkenswerterweise werden diese in der 4d-Zelle in anderen Spiralembryonen exprimiert (Ergänzungstabelle 8), was unsere Schlussfolgerung zur Zelllinie basierend auf dem Fortschreiten des Zellzyklus, Informationen zur Zellposition und der ERK1/2-Aktivität unterstützt. Das ParaHox-Gen cdx, das im Hinterdarm von O. fusiformis im Larvenstadium nachgewiesen wird (Abb. 4e; ergänzende Abb. 6b), wird in 4d und später in den beiden Tochterzellen von 4d (d. h. links) exprimiert und rechte Mesentoblasten oder ML- und MR-Zellen), die ungeteilt bleiben und bis zum Gastrula-Stadium weiterhin aktives di-P-ERK1/2 aufweisen (Abb. 6a, b; ergänzende Abb. 1f). In ähnlicher Weise wird das Notch-Ligand-Delta (ergänzende Abb. 6c, d) in 4d bei 5,5 hpf ausgedrückt, aber auch in den meisten Nachkommen von 1d am Tierpol sowie in tierischen Mikromeren und ektodermalen Derivaten des C- und D- Quadrant am Pflanzenpol (Abb. 5b, c; ergänzende Abb. 5a). Um zu untersuchen, wie ERK1/2 die Aktivierung von cdx und delta steuern könnte, verwendeten wir einen Assay für Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung von Sequenzierungsdaten (ATAC-seq) bei 5 hpf, um Transkriptionsfaktormotive zu identifizieren, die in zugänglichen Chromatinregionen vorhanden sind, die mit diesen beiden Genen assoziiert sind (Abb . 5d). Dazu gehören Motive von Transkriptionsregulatoren, von denen bekannt ist, dass sie durch ERK1/2-Phosphorylierung moduliert werden, wie etwa ETS-, RUNX- und GATA-Faktoren18. Daher scheint die ERK1/2-Diphosphorylierung in 4d die Aktivität von Transkriptionsregulatoren zu steuern, die hintere Schicksale (cdx) und Zell-Zell-Kommunikationsgene (delta) induzieren.

a, b Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung einer Untergruppe von Genen (ERK1/2-abhängig und unabhängig), die den Pflanzenpol 5 bzw. 5,5 Stunden nach der Befruchtung (hpf) strukturieren. Bei 5 hpf (a) wird bei Angabe von 4d (linke Zeichnung) nur der endodermale Marker GATA4/5/6a exprimiert (einschließlich in der 4d-Zelle, Pfeilspitze). Bei 5,5 hpf (b) werden cdx und delta in der 4d-Zelle exprimiert (Pfeilspitzen) und die C- und D-Quadranten-Mikromere, die die 4d-Zelle umgeben, beginnen mit der Expression einer Reihe von Genen, die an der posterodorsalen und mesodermalen Entwicklung beteiligt sind (foxH, wnt1, wntA). , rhox, fer3 und AP2). Zu diesem Zeitpunkt beginnt auch die Expression des anterioren oralen ektodermalen Gens gsc, das nicht direkt durch die ERK1/2-Aktivierung reguliert wird (Pfeilspitzen). In b sind die oberen Rohdaten kolorimetrische In-situ-Hybridisierungen und die untere Reihe sind Z-Stapel-Projektionen von fluoreszierenden In-situ-Hybridisierungen, die auf Kerne (mit DAPI) und Zellgrenzen (mit acetylierter Tubulin-Immunhistochemie) gegengefärbt wurden. In a und b sind alle Tafeln Pflanzenansichten. Beschreibungen für a und b basieren auf mindestens zehn Embryonen pro Stadium aus mindestens zwei biologischen Replikaten. c Schematische Darstellung des vegetativen Pols und der Mikromeren des C- und D-Quadranten um das 4d-Blastomer mit Darstellung der Genexpressionsdomänen (in grün) und abgeleiteten Zellidentitäten der untersuchten Gene bei 5,5 hpf. Maßstabsbalken sind 50 μm. Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu.

a Z-Stapel-Projektionen (pflanzliche Ansichten) der gesamten Immunhistochemie gegen diphosphoryliertes ERK1/2 (di-P-ERK1/2) 7 bis 9 Stunden nach der Befruchtung (hpf). Das 4d-Mikromer spaltet sich mit 7 hpf in die MR- und ML-Tochterzellen (ergänzende Abbildung 1). b Z-Stapel-Projektion (pflanzliche Ansicht) einer fluoreszierenden Ganzkörper-In-situ-Hybridisierung gegen CDX (gelb) im Gastrula-Stadium (9 hpf), gegengefärbt mit DAPI (Kerne) und acetyliertem Tubulin (Zellgrenzen). c Verteilung der Transkriptionsfaktormotive, die in offenen Chromatinregionen um die cdx- (oberer Teil) und Delta- (unterer Teil) Loci bei 5 hpf zugänglich sind. Dunkel- und Hellblau stellen die beiden ATAC-seq-Replikate dar. d-Z-Stapel-Projektionen (pflanzliche Ansichten) von fluoreszierenden Whole-Mount-In-situ-Hybridisierungen gegen foxH von 6 bis 9 hpf (d. h. Gastrulation), gegengefärbt mit DAPI (Kerne), acetyliertem Tubulin (Zellgrenzen) und Phospho-Histone3 (rot; Marker). der Mitose). e Schematische Darstellung der Zellen rund um 4d und MR/ML während der Gastrulation, Darstellung der Expression von foxH basierend auf d. f Anzahl der Zellkontakte für jedes der 4q-Mikromere bei 5,5 hpf basierend auf der Analyse von acht auf Membran-Aktin gefärbten Embryonen. Die 4d-Zelle stellt zu Beginn der Gastrulation mehr Zellkontakte her als jedes andere 4q-Mikromer. g-Z-Stapel-Projektionen (Pflanzenansichten) von fluoreszierenden Whole-Mount-In-situ-Hybridisierungen gegen gsc und AP2 bei 5,5 hpf, gegengefärbt mit DAPI (Kerne) und acetyliertem Tubulin (Zellgrenzen). Eine 4d-Fehlspezifikation erweitert das orale ektodermale Gen gsc und beeinträchtigt die Expression des hinteren Gens AP2, da sich alle 4q-Mikromere (Sternchen) ähnlich verhalten. Die gsc-Expression geht in mit Brefeldin A (BFA) behandelten Embryonen verloren, was darauf hindeutet, dass möglicherweise induktive Signale erforderlich sind. In d und g zeigen Pfeile und Pfeilspitzen auf Ausdrucksdomänen. Beschreibungen für a, b und d basieren auf mindestens zehn Embryonen pro Stadium aus mindestens zwei biologischen Replikaten. Für g gibt die Ergänzungstabelle 9 detaillierte Zahlen an. Maßstabsbalken sind 50 μm. Schematische Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu. ar Archenteron, bl Blastoporus.

Die anderen sechs zusätzlichen ERK1/2-abhängigen Gene strukturieren die Mikromere, die 4d ​​umgeben, bei 5,5 hpf und definieren mesodermale und posteriore ektodermale Domänen (Abb. 5b, c). Der Transkriptionsfaktor foxH (ergänzende Abbildung 6e), der die Mesodermentwicklung während der Gastrulation in Wirbeltierembryonen reguliert, wird in vier Mikromeren neben 4d nachgewiesen (Abb. 5b, c), was dementsprechend zum lateralen Ektomesoderm beitragen könnte zu Abstammungsstudien beim Ringelwurm Urechis caupo37. Während der Gastrulation durchlaufen diese foxH + -Zellen eine asymmetrische Zellteilung an orthogonalen Spaltungsebenen, um schließlich die MR- und ML-Zellen zu umgeben (Abb. 6d, e). Später während der axialen Verlängerung bildet die FoxH-Expression ein hinteres V-förmiges Muster mutmaßlicher mesodermaler Vorläufer, das im Larvenstadium verblasst (ergänzende Abbildung 6b). Die Liganden wnt1 und wntA (ergänzende Abbildung 6f), die während der Entwicklung im Ringelwurm Platynereis dumerilii im hinteren Bereich und im D-Quadranten exprimiert werden, werden in zwei bilateral symmetrischen Mikromersäulen exprimiert, und wntA wird auch in zwei zusätzlichen D-Quadranten-Mikromeren nachgewiesen (Abb. 5b, c). Die Homöobox rhox (ergänzende Abbildung 6g), die in männlichen und weiblichen Urkeimzellen bei Wirbeltieren exprimiert wird, wird in zwei pflanzlichen Mikromeren im D-Quadranten (Abb. 5b, c) und danach in zwei kleinen Zellen innerhalb der Blastozele nachgewiesen in der Gastrula (Ergänzende Abb. 5e). Die Transkriptionsfaktoren fer3 und AP2 werden in zwei einzelnen Mikromeren bzw. in einer breiteren hinteren ektodermalen Domäne exprimiert und sind auf eine kleine Expressionsdomäne am oder in der Nähe des hinteren Chaetalsacks der Larve beschränkt (Abb. 5b, c; ergänzende Abb. 5c). und 6b). Bemerkenswert ist, dass die 4d-Zelle, die eine größere Zellgröße als die anderen 4q-Mikromere aufweist, da sie sich bei 5, 5 und 6 hpf nicht teilt (ergänzende Abbildung 1), fast doppelte direkte Zell-Zell-Kontakte mit ihren umgebenden Zellen herstellt – einschließlich der meisten der Zellen, die foxH, wnt1, wntA, rhox und AP2 exprimieren – als jede der Tochterzellen von 4a – c (Abb. 6e). Daher stützen diese Ergebnisse eine wahrscheinliche induktive Rolle des 4d bei der Definition mesodermaler und posterodorsaler Schicksale, obwohl Zellablations- und/oder Zelltransplantationsstudien erforderlich sind, um diese Hypothese experimentell zu validieren.

Das Homeobox-Gen gsc ist der einzige Kandidat, der außerhalb des D-Quadranten mit 5,5 hpf exprimiert wird und in einer U-förmigen Domäne von Mikromeren der A-, B- und C-Quadranten nachgewiesen wird, die den voraussichtlichen anterolateralen Blastoporalrand besetzen (Abb. 5b, c). . Die Expression von gsc ist unabhängig von der ERK1/2-Aktivität, was mit seiner Position außerhalb des D-Quadranten übereinstimmt, wird jedoch nach der BFA-Behandlung herunterreguliert (Supplementary Data 1). Dementsprechend verschwindet die gsc-Expression in BFA-behandelten Coeloblastulae, während die Hemmung der ERK1/2-Aktivität mit U0126 die gsc-Domänen erweitert, was in allen embryonalen Quadranten radial nachgewiesen wird (Abb. 6f; Ergänzungstabelle 9). Tatsächlich spalten sich in ERK1/2-inhibierten Embryonen alle 4q-Mikromeren in 4q1 und 4q2, da kein 4q zur 4d-Zelle wird (Abb. 6f). Daher nehmen alle Quadranten anteroventrale Schicksale (gsc) an und verhindern so die Expression posteriorer Markergene wie AP2 (Abb. 6f; Ergänzungstabelle 9). Diese Ergebnisse zeigen, dass der nach U0126 beobachtete radiale Phänotyp eine Folge einer Fehlspezifizierung der 4d-Zelle ist und nicht eine Folge einer Spezifizierung des D-Quadranten, die sich aber nicht weiterentwickelt. Darüber hinaus zeigen diese Daten auch, dass die Spezifizierung der 4d-Zelle durch ERK1/2-Aktivität das anteriore Schicksal unterdrückt, wie durch die Einschränkung der gsc-Expression gezeigt wird.

Die Hochregulierung des Notch-Liganden-Delta in 4d nach der ERK1/2-Aktivierung legt nahe, dass die Rolle von 4d bei der Förderung der posterodorsalen Entwicklung durch direkte Zell-Zell-Kommunikation, vermittelt durch den Notch-Signalweg, erfolgen könnte. Um diese Hypothese zu testen, behandelten wir Embryonen vor und nach der Spezifikation von 4d mit dem kleinen Molekül LY411575, einem selektiven Inhibitor der Gamma-Sekretase, der die aktive intrazelluläre Notch-Domäne bei Notch-Aktivierung durch Delta46 spaltet (Abb. 7a, b). . Larven, die aus Embryonen wachsen, die von der Befruchtung bis zu 5 hpf mit LY411575 behandelt wurden, weisen einen normalen Phänotyp mit offensichtlicher bilateraler Symmetrie und normaler Organogenese auf (Abb. 7b – e; Ergänzungstabelle 10). Allerdings führt die Hemmung des Notch-Signalwegs ab 5 hpf, wenn die ERK1/2-Aktivität die 4d-Zelle spezifiziert, zu Larven mit bilateraler Symmetrie, einem durchgehenden Darm mit vollständig anteriorisiertem Mund, einem apikalen Organ, aber kürzeren posterodorsalen Geweben, einem Phänotyp wir nennen Sie „stubby“ (Abb. 7b, c, f; Ergänzungstabelle 10). Dementsprechend exprimieren diese Larven GSC im vorderen oralen Ektoderm und haben einen kurzen Hinterdarm, der CDX exprimiert (Abb. 7g; Ergänzungstabelle 11). Der „stummelige“ Phänotyp unterscheidet sich daher von dem radialen Phänotyp, der bei der Hemmung von ERK1/2 beobachtet wird, darin, dass im ersteren axiale Identitäten angegeben werden, im letzteren jedoch nur anteroventrale Schicksale (Ergänzungstabelle 3). Bemerkenswerterweise exprimiert das posterodorsale Ektoderm der Gastrula einen kerbenartigen Liganden, dessen Expression, wie für Delta beobachtet, durch die ERK1/2-Aktivität reguliert wird (Abb. 4d; ergänzende Abb. 5f). Zusammengenommen unterstützen unsere Ergebnisse, dass die Aktivierung von ERK1/2 in der 4d-Zelle die Notch-Signalübertragung in dieser und den umgebenden posterodorsalen Zellen erleichtert, was für die normale Entwicklung der posterioren und dorsalen Strukturen insgesamt notwendig ist. Weitere Studien werden jedoch das genaue Genregulationsnetzwerk aufklären, das die ERK1/2- und Notch-Signalisierung zur Steuerung der axialen Entwicklung in O. fusiformis verbindet.

a Schematische Darstellung des Notch-Delta-Signalwegs, wobei der Delta-Ligand in der 4d-Zelle exprimiert wird (siehe Abb. 5b) und ein Notch-Rezeptor in seinen Nachbarzellen (Abb. 4d). b Schematische Darstellung der beiden in dieser Studie durchgeführten medikamentösen Behandlungsfenster (die Anzahl der Fälle wird rechts von jedem Balken angezeigt, der das Zeitintervall angibt). Um die Rolle des Notch-Signalwegs nach der Delta-Hochregulierung in 4d zu beurteilen, haben wir Embryonen vor und nach seiner Spezifikation behandelt. c Verteilung und Prozentsätze der beobachteten Larvenphänotypen für jedes Fenster und jede Versuchsbedingung (WT, Wildtyp). d Z-Stack-Projektionen von Kontroll- und LY411575-behandelten Embryonen (von 0 bis 5 hpf), gefärbt mit DAPI (Kerne) und acetyliertem Tubulin (AcTub; Zilien). Kontroll- und behandelte Embryonen zeigen eine normale Morphologie. e Seitenansichten der gesamten In-situ-Hybridisierung von Markern für apikale neurale Zelltypen (syt1; Synaptotagmin-1), orales Ektoderm (gsc) und von 4d abgeleitete Gewebe und Hinterdarm (cdx) in einem Behandlungszustand wie in d. Kontrolle und Larven behandelter Embryonen zeigen normale Genexpressionsmuster. Einfügungen sind ventrale Ansichten und Pfeile zeigen auf Ausdrucksdomänen. f-Z-Stack-Projektionen von Kontroll- und LY411575-behandelten Embryonen (von 5 bis 25 hpf), gefärbt mit DAPI (Kerne) und acetyliertem Tubulin (AcTub; Zilien). Larven aus behandelten Embryonen weisen eine bilaterale Symmetrie und ein normales apikales Organ auf, haben jedoch eine reduzierte posterodorsale Seite, einen kürzeren/abnormalen Hinterdarm und eine unterentwickelte Chaetalregion. Wir haben diesen Phänotyp „stummelig“ genannt. e Seitenansichten der gesamten In-situ-Hybridisierung von Markern für apikale neurale Zelltypen (syt1; Synaptotagmin-1), orales Ektoderm (gsc) und von 4d abgeleitetes Gewebe und Hinterdarm (cdx) in einem Behandlungszustand wie in f. Einfügungen sind ventrale Ansichten und Pfeile zeigen auf Ausdrucksdomänen. In d–g markieren Sternchen den vorderen/apikalen Pol. Beschreibungen für b basieren auf mindestens zehn Embryonen pro Stadium aus mindestens zwei biologischen Replikaten. Für b–g enthält die Ergänzungstabelle 11 detaillierte Zahlen. Maßstabsbalken sind 50 μm. ch Chaetae, hg Hinterdarm, mg Mitteldarm, mo Mund, pt Prototroch.

In Wirbeltierembryonen reguliert die durch ERK1/2-Aktivität vermittelte FGF-Signalübertragung die Expression von cdx und delta im sich entwickelnden Hinterdarm und im präsomitischen Mesoderm während der hinteren Rumpfverlängerung47. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die FGF-Signalübertragung der vorgeschaltete Regulator sein könnte, der die ERK1/2-Aktivität in 4d in O. fusiformis antreibt (Abb. 8a), der auch erforderlich ist, um die Expression von cdx und delta zu induzieren und den mesodermalen Vorläufer von Hinterdarm und Rumpf zu spezifizieren. Owenia fusiformis verfügt über einen einzelnen FGF-Rezeptor (FGFR; ergänzende Abbildung 7a) mit hoher Aminosäurekonservierung an wichtigen funktionellen Resten im Vergleich zum menschlichen FGFR1-Ortholog (ergänzende Abbildung 7b). Während es im Gastrula-Stadium transkriptionell hochreguliert ist und hauptsächlich in mesodermalen Derivaten ab Gastrula exprimiert zu werden scheint (ergänzende Abbildung 7c, d), scheint FGFR im Coeloblastula-Stadium in O. fusiformis in der Magenplatte schwach exprimiert zu sein (Abb. 8b). ), wie auch bei Brachiopoden und Phoroniden beobachtet48. Zu diesem Zeitpunkt werden FGF-Liganden nur schwach exprimiert (ergänzende Abbildung 7c) und durch In-situ-Hybridisierung nicht nachgewiesen. Die Behandlung mit 30 µM SU5402, einem selektiven Inhibitor der FGFR-Phosphorylierung und -Aktivierung49 (Abb. 8a), verhindert die Anreicherung von di-P-ERK1/2 bei 4d-Zellen in 96 % der behandelten Embryonen bei 5 hpf (Abb. 8c; ergänzende Abb. 7e). Tatsächlich führt die Behandlung mit SU5402 während der Spezifikation des 4d-Mikromers (4–6 hpf und 3–7 hpf; Abb. 6c; Ergänzungstabelle 12) zu einem anterior radialisierten Phänotyp, wobei sich Embryonen zu Larven entwickeln, denen die posteriore Expression (Hinterdarm- und CDX-Expression) fehlt ) und reduzierte mesodermale (Muskeln und Drehungsausdruck) Strukturen und zeigen radial ausgedehnte orale ektodermale Schicksale (gsc) (Abb. 8g; Ergänzungstabelle 3). Daher ähnelt dieser radiale Phänotyp aus morphologischer Sicht und aus Sicht der Genmarker dem, der nach Hemmung der ERK1/2-Diphosphorylierung mit U0126 und BFA erhalten wird. Umgekehrt führt die Behandlung vor der Anreicherung von di-P-ERK1/2 in 4d (3–5 hpf) zu einem leicht komprimierten Phänotyp (ergänzende Abbildung 6f), der auch dem ähnelt, der bei der Blockierung des intrazellulären Proteintransports mit BFA zu äquivalenten Zeitpunkten beobachtet wird . Daher blockiert die Hemmung von FGFR die ERK1/2-Aktivierung und phänokopiert die Wirkung von U0126 und BFA (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass die FGF-Signalaktivität vor der 4d-Spezifikation in O. fusiformis liegt und für diese notwendig ist.

a Schematische Darstellung des nachgeschalteten intrazellulären FGFR-Signalwegs. Das Medikament SU5402 hemmt spezifisch die Tyrosinkinase-Rezeptoren vom Typ FGF/VEGF, die über die ERK1/2-Signalkaskade Signale senden können. b Whole-mount-in-situ-Hybridisierung für FGFR und VEGFR im Coeloblastula-Stadium in O. fusiformis. FGFR wird zum Zeitpunkt des 4d-instruierten posterioren Re-Patterns schwach an der Magenplatte exprimiert. Allerdings wird VEGFR, das durch die Behandlung mit SU5402 ebenfalls gehemmt werden kann, zu diesem Zeitpunkt noch nicht exprimiert. c Whole-Mount-Immunhistochemie gegen diphosphoryliertes ERK1/2 (di-P-ERK1/2). Mit SU5402 behandelte Embryonen verlieren 5 Stunden nach der Befruchtung (hpf) die ERK1/2-Anreicherung in einem pflanzlichen Mikromer. Die Hauptbilder sind Seitenansichten und die Einfügungen sind Pflanzenansichten. d Schematische Darstellung der in dieser Studie durchgeführten medikamentösen Behandlungsfenster, die auf den Zeitraum der 4-Tage-Spezifikation (5 hpf) abzielen. Die Anzahl der Fälle wird rechts neben jedem Balken angezeigt und gibt das Zeitintervall an. e Verteilung und Prozentsätze der beobachteten Larvenphänotypen für jedes Fenster und jede Versuchsbedingung (WT, Wildtyp). f Seitenansichten von Z-Stack-Projektionen von Kontroll- und 4–6 HPF SU5402-behandelten Embryonen, die im Larvenstadium fixiert und mit DAPI (Kerne), Phalloidin (F-Actin) und acetyliertem Tubulin (Zilien) gefärbt wurden. Behandelte Larven zeigen eine Phänokopie des radialen Larvenphänotyps U0126. Auf der linken Seite schematische Darstellungen von Seitenansichten der Kontroll- und Radiallarven-Phänotypen. g Seitenansichten der gesamten In-situ-Hybridisierung von fünf Zelltypmarkern in der Kontrolle und mit 4–6 HPF SU5402 behandelten Embryonen, die im Larvenstadium fixiert wurden. Behandelte Embryonen entwickeln sich zu radialisierten Larven mit erweiterten oralen ektodermalen Markern (gsc), reduzierten apikalen ektodermalen Markern (sechs 3/6), fehlenden mesodermalen Genen für Hinterdarm und Rumpf (cdx bzw. Twist) und normalen Mitteldarmmarkern (GATA4/5/6b). . Einfügungen sind ventrale Ansichten. In b, c, f und g zeigen Sternchen auf den apikalen Pol. Für d–g enthält die Ergänzungstabelle 12 detaillierte Zahlen. Maßstabsbalken sind 50 μm. Schematische Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu. ein Anus, ao apikales Organ, Ch Chaetae, gp Magenplatte, mg Mitteldarm, mo Mund, pt Prototroch.

Durch die Kombination der funktionellen Charakterisierung der FGFR-, ERK1/2- und Notch-Signalwege mit vergleichender Transkriptomik in O. fusiformis, einem Ringelwurm mit bedingtem Entwicklungsmodus, löst unsere Studie seit langem bestehende Fragen8 zu den genetischen Prinzipien der Vorfahren, die die frühe Körpermusterung während der Spiralspaltung steuern. Anders als bei autonomen Ringelwürmern25,26,27,28 liefert unsere Studie überzeugende Beweise dafür, dass FGFR- und ERK1/2-Signale eine axiale Musterung induzieren, indem sie das 4d-Mikromer – den mutmaßlichen embryonalen Organisator – spezifizieren und nachgeschaltete Gene aktivieren, die am Mesoderm und Posterodorsal beteiligt sind Entwicklung in O. fusiformis (Abb. 9a). Wie bei einigen Weichtieren 10, 20 beobachtet, unterbricht die FGFR/ERK1/2-Aktivität die quatriradiale Symmetrie des Embryos, indem sie das Fortschreiten des Zellzyklus in der 4d-Zelle verzögert (Abb. 2e; Abb. 6f; ergänzende Abb. 1c, d) und Daher scheint es eine allgemeine Rolle der ERK1/2-Signalübertragung im Zusammenhang mit der axialen Musterung in spiralförmigen Embryonen zu sein, die Zellteilung zu stoppen, statt sie zu fördern18. Gleichzeitig mit der Spezifikation der 4d- und posterodorsalen Identitäten werden die anterioren Schicksale auf die A-C-Quadranten beschränkt (Abb. 6f), was darauf hindeutet, dass unbekannte gegensätzliche Signale – eines, das anteriore Schicksale spezifiziert und ein anderes die 4d-Spezifikation über FGFR/ERK1/2 steuert – möglicherweise vorhanden sind wirken gleichzeitig, um die axiale Polarität in O. fusiformis zu definieren (Abb. 9a). Während weitere Arbeiten zur Identifizierung dieser Signale erforderlich sind, gehen wir davon aus, dass der anteriorisierende Hinweis entweder von Zelllinien stammen muss, die in diesen Stadien bereits spezifiziert wurden (z. B. dem Mitteldarm und dem apikalen Organ), oder von zellautonomen mütterlichen Determinanten, die selektiv aus dem Mitteldarm und dem apikalen Organ entfernt werden D-Quadrant nach 4D-Spezifikation. Darüber hinaus reguliert die FGFR/ERK1/2-Aktivität das Notch-Ligand-Delta in der 4d-Zelle und einen Notch-ähnlichen Rezeptor im posterodorsalen Ektoderm der Gastrula (Abb. 4d; Abb. 5b) und damit die Notch-Delta-Signalisierung hoch – a Der Signalweg, der allgemein zur Feinabstimmung des Zellschicksals durch direkte Hemmung/Induktion von Zelle zu Zelle verwendet wird, ist einer der nachgeschalteten Effektoren, die für die posterodorsale und mesodermale Entwicklung in O. fusiformis erforderlich sind (Abb. 7f, g; Abb. 9a). Insgesamt stellen unsere Ergebnisse ein umfassendes Modell der frühen Entwicklung eines Ringelwürmers mit bedingter Spiralspaltung dar und bilden die Grundlage für weitere Studien, die die genaue regulatorische Logik analysieren, die der Körperstrukturierung dieser Tiergruppe und Spiralia im Allgemeinen zugrunde liegt.

ein schematisches Modell der FGFR/ERK1/2-Aktivität im 4d-Mikromer während der späten Spiralspaltung in O. fusiformis. 4 Stunden nach der Befruchtung (hpf) ist diphosphoryliertes ERK1/2 (di-P-ERK1/2) in den apikalsten Mikromeren (1q111) angereichert. Bei 5 hpf aktiviert ein nicht identifiziertes Signal den FGF-Rezeptor, der ERK1/2 im 4d-Mikromer diphosphoryliert. Dies aktiviert cdx und delta in 4d (und wird zum endomesodermalen Vorläufer), was auch damit korreliert, dass 4d seinen Zellzyklus stoppt, da 4a–4c gespalten wird. Die ERK1/2-Aktivierung in 4d ist erforderlich, um anteriore Gene (z. B. gsc) auf die A–C-Quadranten zu beschränken, die genaue Art dieser Interaktion ist jedoch unklar (gepunktete Linien). Darüber hinaus induziert die ERK1/2-Aktivität in 4d die Expression einer Reihe von Genen im D-Quadranten und einem Teil des C-Quadranten, die wahrscheinlich laterale mesodermale und posterodorsale Schicksale induzieren und letztendlich die axiale Verlängerung steuern. Ab diesem Stadium ist der Notch-Delta-Signalweg für die normale posterodorsale Entwicklung erforderlich und könnte dazu beitragen, die induktive Aktivität der 4d-Zelle auf benachbarte Zellen zu übertragen (gepunktete Linie). b Schematische Zeichnungen von Embryonen zum Zeitpunkt der anteroposterioren axialen Verlängerung in verschiedenen bilateralen Abstammungslinien, wobei links die Wechselwirkungen zwischen FGFR, ERK1/2 und einigen der in dieser Studie identifizierten Kandidatengene in jeder Abstammungslinie dargestellt sind. Die ähnliche Beteiligung der ERK1/2-Aktivierung an der Spezifikation des D-Quadranten-Embryonalorganisators in O. fusiformis und anderen Molluskenembryonen legt nahe, dass das Vorhandensein eines ERK1/2-positiven Embryonalorganisators ein gemeinsames Vorfahrenmerkmal der Spiralspaltung ist. Im weiteren Sinne induziert die ERK1/2-Aktivität die Expression einer Reihe von Genen und Signalwegen, die wiederholt an der axialen Strukturierung und dem hinteren Rumpfwachstum in bilateralen Embryonen beteiligt sind. Während die axiale Organisation und die Bildung eines hinteren Elongationszentrums in den meisten bilateralen Abstammungslinien meist räumlich und zeitlich entkoppelt sind, werden sie bei Spiralianern in einen einzigen Entwicklungsprozess embryonaler Organisationsaktivität integriert (dh die Spezifikation des embryonalen Organisators des D-Quadranten). . Zeichnungen sind nicht maßstabsgetreu. A anterior, P posterior, D dorsal, V ventral.

Die Aktivierung von FGFR/ERK1/2 im 4d-Blastomer zur Kontrolle axialer Identitäten und Körpermuster in O. fusiformis steht im Einklang mit der Aktivität von ERK1/2 in der 4d-Zelle im bedingten Ringelwurm H. hexagonus20. Es spiegelt auch den bei Weichtieren beobachteten Zustand wider, der trotz etwas unterschiedlicher Muster der frühen ERK1/2-Aktivität (Ergänzungstabelle 1) im Allgemeinen aktives diphosphoryliertes ERK1/2 verwendet, um den posterodorsalen embryonalen Organisator in beiden 3D-Blastomeren zu spezifizieren und zu regulieren oder seine Tochterzelle 4d. Tatsächlich wird der Beitrag von 4d zum Hinterdarm bei O. fusiformis auch bei Mollusken beobachtet51,52, jedoch nicht bei einigen autonomen Ringelwürmern53, und die Notch-Signalisierung könnte auch die potenzielle instruktive Rolle der 4d-Zelle in der Molluske Tritia obsoleta54 untermauern (Abb. 9a). ). Die Spezifikation des D-Quadranten und des embryonalen Organisators beruht jedoch auf direkten Zell-Zell-Kontakten – und derzeit unbekannten induktiven Signalen – zwischen tierischen Mikromeren und der potenziellen 3D-Zelle in Weichtieren55, was bei O. fusiformis30 und anderen bedingten Ringelwürmern29 wahrscheinlich nicht vorkommt große Blastozelen zum Zeitpunkt der Bildung der 4q-Mikromeren. Folglich könnten sich die vorgeschalteten Regulatoren der ERK1/2-Aktivität in den 3D/4d-Zellen zwischen Mollusken und Ringelwürmern unterscheiden, und daher besteht die Möglichkeit, dass die zwischen diesen beiden Gruppen beobachteten Ähnlichkeiten in den intrazellulären Signalwegen und Messwerten während der axialen Spezifikation darauf zurückzuführen sind konvergente Entwicklung. Ein alternatives, sparsameres Szenario besteht jedoch darin, dass die Aktivierung und axiale Strukturierungsrolle von ERK1/2 in der Zelle, die als embryonaler Organisator fungiert, homolog zu Annelida und Mollusca ist (Abb. 9b) und somit ein grundlegendes Merkmal der Spiralspaltung ist. Die in autonomen Ringelwürmern beobachtete Reihe von ERK1/2-Mustern (Ergänzungstabelle 1) würde somit unabhängige Verluste eines angestammten ERK1/2+-Organisators darstellen, die möglicherweise mit einem Übergang zu einem autonomen Modus der Zellschicksalsspezifikation zusammenhängen. In Zukunft wird ein besseres Verständnis der vorgelagerten Genregulationsnetzwerke, die die ERK1/2-Aktivität in Ringelwürmern und Weichtieren steuern, dazu beitragen, dieses Szenario zu testen und die Mechanismen zu analysieren, die die Variabilität in der zellulären Identität des embryonalen Organisators in Spiralia fördern.

Generell deckt unsere Studie auffällige Ähnlichkeiten zwischen der molekularen Kaskade, die den embryonalen Organisator und die posterodorsalen Identitäten bei bedingten Spiralianern spezifiziert, und den Genmodulen auf, die die axiale Musterung und das hintere Wachstum bei Deuterostomia und Ecdysozoa 47, 48, 56, 57, 58 regulieren (Abb. 9b; Ergänzung). Tabelle 13). Obwohl die genauen regulatorischen Logiken zwischen den großen Abstammungslinien – und manchmal sogar zwischen phylogenetisch verwandten Kladen – variieren, ist die ERK1/2-Aktivität von zentraler Bedeutung für die dorsoventrale Musterung bei Stachelhäutern, Hemichordaten und Chordaten und trägt zusammen mit FGFR zum hinteren Wachstum bei Chordaten bei und fördert die Expression von cdx und delta am hinteren Ende des wachsenden Schwanzes (Abb. 9b; Ergänzungstabelle 14 und darin enthaltene Referenzen). In ähnlicher Weise steuert die FGFR-Signalübertragung die dorsoventrale Musterung bei einem Arthropoden, der Spinne Parasteatoda tepidariorum (Ergänzungstabelle 14). Der Notch-Delta-Signalweg ist auch an der hinteren Verlängerung bei Hemichordaten, Chordaten und Arthropoden beteiligt und steuert die hintere und dorsoventrale Identität bei Nematoden (Abb. 9b; Ergänzungstabelle 14 und darin enthaltene Referenzen). Daher untermauern alte und weitgehend konservierte genetische Prinzipien und Entwicklungsprinzipien den bedingten Modus der Zellschicksalspezifikation bei der Spiralspaltung, was die Ansicht weiter untermauert, dass dieser Entwicklungsmodus den angestammten Zustand in Spiralia darstellt11,12,13. Anders als bei anderen frühen Embryogenesen jedoch kombiniert die Spiralspaltung mit ihrem höchst einzigartigen stereotypen Muster der Zellteilung und frühen Entwicklung mit einer reduzierten Anzahl von Blastomeren die Anweisung axialer Identitäten und der hinteren Entwicklung zeitlich und räumlich in einer einzigen organisierenden Zelle – der 3D/4d bei Weichtieren und höchstwahrscheinlich die 4d-Zelle bei Ringelwürmern (Abb. 9b). Wie diese Zelle und ihre konservierte instruktive Musterfunktion die spätere Entwicklung tiefgreifend unterschiedlicher adulter Morphologien in Spiralia fördert, bleibt eine offene Frage, die durch eine detaillierte Untersuchung der genetischen Module stromabwärts des D-Quadranten-Organisators über Spirallinien hinweg gelöst werden kann.

Ausgewachsene Exemplare von O. fusiformis Delle Chiaje, 1844 wurden während der Fortpflanzungszeit (Mai–Juli) an der Küste in der Nähe der Station Biologique de Roscoff (Frankreich) gesammelt. Im Labor wurden die Tiere in künstlichem Meerwasser (ASW) bei 15 °C gehalten. In-vitro-Fertilisationen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt3,30 und Embryonen entwickeln sich in Glasschüsseln mit gefiltertem ASW bei 19 °C bis zum gewünschten Embryonalstadium.

Embryonen wurden entweder mit Brefeldin A (BFA; Sigma-Aldrich, #B7651), U0126 (Sigma-Aldrich, #U120), LY411575 (Sigma-Aldrich, #SML0506) oder SU5402 (Sigma-Aldrich, #572630) behandelt. Alle Arzneimittelvorräte wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt und vor der Verwendung in ASW verdünnt, wobei nach der ersten Titration optimale Arbeitskonzentrationen (10 µM für BFA und U0126, 100 µM für LY411575 und 30 µM für SU5402) ermittelt wurden. Für alle medikamentösen Behandlungen wurden äquivalente DMSO-Volumina als Negativkontrolle verwendet, und in allen Fällen wurden die Behandlungen etwa 0,5 Stunden nach der Befruchtung (hpf), direkt nach der Befruchtung und der Spermienentfernung oder wie in den einzelnen Abbildungen angegeben begonnen. Die Behandlungen wurden durch Auswaschen des Arzneimittels mit mindestens drei Wäschen in ASW beendet und die Embryonen wurden entweder für nachgelagerte Analysen gesammelt oder bis zum Larvenstadium aufgezogen. Für Immunhistochemie und Genexpressionsanalysen gesammelte Proben wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (RT) in 4 % Paraformaldehyd (PFA) in ASW fixiert. Die Larven wurden vor der Fixierung in 8 % Magnesiumchlorid (MgCl2) entspannt und 1 Stunde lang bei RT in 4 % PFA in 8 % MgCl2 fixiert. Nach der Fixierung wurden die Proben mehrmals mit 0,1 % phosphatgepufferter Tween-20-Kochsalzlösung (PTw) gewaschen und entweder für die Immunhistochemie in PTw bei 4 °C gelagert oder auf 100 % Methanol dehydriert und für die gesamte Einlagerung bei –20 °C gelagert Situ-Hybridisierung. Behandelte und Kontrollembryonen und -larven, die für RNA-seq-Analysen gesammelt wurden, wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und vor der vollständigen RNA-Extraktion bei –80 ° C gelagert.

Die F-Actin-Markierung und die Antikörperfärbung wurden wie zuvor beschrieben30 durchgeführt, mit der Änderung, dass die für die Anti-di-P-ERK1/2-Färbung gesammelten Proben in PTw gewaschen wurden, ergänzt mit einer 1:100-Verdünnung von Phosphataseinhibitoren (Cell Signalling, Nr. 5872). ) nach der Fixierung. Die Primärantikörper Maus-anti-doppelt phosphoryliertes ERK1/2 (Sigma-Aldrich, #M8159, 1:200) und Maus-anti-acetyliertes α-Tubulin (Klon 6-11B-1, Millipore-446 Sigma, #MABT868, 1:500). ) wurden in 5 % normalem Ziegenserum (NGS) in 0,1 % phosphatgepufferter Triton X-100-Salzlösung (PTx) verdünnt und über Nacht (ON) bei 4 °C inkubiert. Nach mehreren Wäschen in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PTx wurden die Proben entweder mit einem Anti-Maus-Peroxidase (POD)-konjugierten Antikörper (Millipore-Sigma, Nr. 11207733910, 1:100) oder einem AlexaFluor594-konjugierten Antikörper inkubiert. ThermoFisher Scientific, #A32731, 1:600), verdünnt in 5 % NGS in PTx ON bei 4 °C. Für Proben, die mit Maus-anti-doppelt phosphoryliertem ERK1/2 und anti-Maus-POD-konjugiertem Antikörper inkubiert wurden, wurde das Signal entweder mit Diaminobenzidin (DAB) (Vector Laboratories, #SK-4100) oder einem Tyramide Signal Amplification Kit (Akoya Biosciences, #NEL742001KT) entwickelt ) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Mit DAB entwickelte Proben wurden in 70 % Glycerin gelagert und mit dem Kernmarker 4‘,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, ThermoFisher Scientific, #D3571, 1:1000) gegengefärbt. Proben für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSCM) wurden mit DAPI, verdünnt in 1 % Rinderserumalbumin (BSA), in PTx für 1 Stunde bei RT gegengefärbt und in 70 % Glycerin montiert.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem Monarch Total RNA Miniprep Kit (New England Biolabs, #T2010) extrahiert und für die Vorbereitung der Illumina-Strang-mRNA-Bibliothek verwendet. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina HiSeq 4000-Plattform im 75-Basen-Paired-End-Ausgabemodus durchgeführt und generierte etwa 20 Millionen Lesevorgänge pro Probe. Adaptersequenzen und Basen geringer Qualität wurden mit Trimmomatic v.0.3659 entfernt. Bereinigte Lesevorgänge wurden dann mithilfe von Kallisto v.0.44.0 der O. fusiformis-Referenzgenomannotation33 (verfügbar im European Nucleotide Archive unter der Zugangsnummer GCA_903813345) zugeordnet, um Genexpressionszahlen zu generieren60. Differenzielle Genexpressionsanalysen wurden für jedes Medikament unabhängig durchgeführt und in paarweisen Vergleichen verschiedener Stadien und Zustände unter Verwendung des R-Pakets DEseq2 v.1.38.061 berechnet. Die Signifikanzschwelle wurde auf einen p-Wert ≤ 0,05 und eine Log2-fache Änderung >1,5 oder <–1,5 angepasst (Ergänzungsdaten 1). PCAs und hierarchisches Clustering wurden mit den Paketen ggplot2 bzw. pheatmap R dargestellt. Vulkandiagramme wurden mit dem Paket EnhancedVolcano erstellt, das in R erhältlich ist. Kandidatengene für weitere Genexpressionsanalysen wurden auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Expression in beiden Arzneimittelbehandlungen (U0126 und BFA) oder ihrer stark unterschiedlichen Expression bei 5,5 hpf in mit U0126 behandelten Embryonen ausgewählt. Wir haben unsere Auswahl anhand der Kategorien der Genontologie (GO) (Ergänzungsdaten 2) weiter verfeinert und uns dabei auf Transkriptionsfaktoren und Entwicklungsgene konzentriert (Ergänzungstabelle 6).

Für die GO-Kartierung wurden die GO-Begriffe der mit jedem Vergleich assoziierten differentiell exprimierten Gene aus der O. fusiformis-Referenzgenomanmerkung33 extrahiert (verfügbar im Repository https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). GO-Anreicherungsanalysen wurden mithilfe des GOseq R-Pakets durchgeführt, wobei Genlängenverzerrungen korrigiert wurden62 und hochregulierte und herunterregulierte Gene unabhängig analysiert wurden. GO-Terme mit korrigierten p-Werten <0,05 wurden als signifikant angereichert angesehen (Supplementary Data 2). Ein ähnlicher Ansatz wurde für die Signalweganreicherungsanalysen der Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) verfolgt, bei denen unterschiedlich dargestellte KO-Zahlen ihrem jeweiligen KEGG-Signalweg zugeordnet wurden (Ergänzungsdaten 1).

Im Allgemeinen basierte die Genorthologie auf der funktionellen Annotation des O. fusiformis-Genrepertoires, basierend auf BLAST-Suchen in der SwissProt-Datenbank und Panther-Suchen (funktionale Annotation verfügbar im Repository https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Proteinsequenzen für ERK1/2 und ERK5, WNT-Liganden, RHOX und verwandte Homöoboxen, DLL- und JAGGED-, FOXH- und FOXF-Gene sowie FGFR und VEGFR wurden durch Durchsuchen öffentlich verfügbarer Transkriptome und Datenbanken ermittelt. Mehrere Protein-Alignments (verfügbar in Supplementary Data 1) wurden mit MAFFT v.7 im automatischen Modus63 erstellt und schlecht ausgerichtete Regionen wurden mit gBlocks Version 0.91b64 entfernt. Maximum-Likelihood-Bäume wurden entweder mit RAxML v.8.2.1165 oder FastTree66 erstellt und mit FigTree (https://github.com/rambaut/figtree/) visualisiert. InterProScan 567 wurde verwendet, um die Proteindomänenzusammensetzung von DLL durchzuführen.

Kandidatengene (Ergänzungstabelle 6) und Genmarker, die zur Charakterisierung der Arzneimittelphänotypen verwendet wurden, wurden durch zwei Runden verschachtelter PCR unter Verwendung genspezifischer Primer und eines T7-Universalprimers auf cDNA aus gemischten Entwicklungsstadien als anfängliche Vorlage amplifiziert. Ribosonden wurden mit dem T7-Enzym (Ambions MEGAscript-Kit, Nr. AM1334) synthetisiert und in Hybridisierungspuffer in einer Konzentration von 50 ng/μl bei –20 °C gelagert. Die kolorimetrische und fluoreszierende Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung wurde nach einem etablierten Protokoll3,30 durchgeführt. Nach dem Waschen der Sonde wurden die Proben für die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung mit Anti-DIG-POD-Fab-Fragmenten (ROCHE, #11633716001) und einem Maus-anti-acetylierten α-Tubulin-Antikörper (Klon 6-11B-1, Millipore-446 Sigma, #) inkubiert. MABT868, 1:500) zur Co-Färbung von Zellgrenzen. Nach der Signalentwicklung mit einem Tyramide Signal Amplification Kit (Akoya Biosciences, #NEL742001KT) wurden diese Proben mehrmals in PTx gewaschen und wie oben beschrieben für die sekundäre Antikörperinkubation behandelt. Um die Dynamik der Genexpression während der Entwicklung in silico zu charakterisieren, verwendeten wir einen verfügbaren stadienspezifischen RNA-seq-Datensatz33, der die durchschnittliche Expression der beiden Replikate mit dem in R verfügbaren Paket pheatmap v.1.0.12 darstellt, wobei die Farbintensität die z- Score-Wert für jedes Gen.

Wir verwendeten eine Kombination aus sechs morphologischen und sechs molekularen Markern, um die nach allen Arzneimittelbehandlungen erhaltenen Phänotypen zu charakterisieren (Ergänzungstabelle 3). Kurz gesagt wurden visuelle Inspektion und Z-Stapel-Projektionen von konfokalen Scanbildern verwendet, um das Vorhandensein von Chaetae, Vorderdarm und Hinterdarm, Muskeln (im Vorderdarm, Chaetoblasten und Levatoren), apikalem Organ (mit apikalem Zilienbüschel) und apikalen Organneuronen zu beurteilen . Um das Vorhandensein/Fehlen dieser Larvenstrukturen zu belegen, haben wir die Expression zelltypspezifischer molekularer Marker durch kolorimetrische Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung beurteilt, nämlich six3/6 (apikales Ektoderm und Ösophagus), gsc (anteriores orales Ektoderm), cdx (Hinterdarm), GATA4/5/6 (Mitteldarm), Twist (Mesoderm) und Synaptotagmin-1 (Neuronen). Wir definieren den komprimierten Phänotyp als eine Larve mit einer Morphologie und molekularen Musterung wie ein Wildtyp, jedoch mit einer abgeflachten apikal-ventralen Achse. Dem radialen Phänotyp fehlen Hinterdarm- und mesodermale Strukturen und Marker und er zeigt eine radialisierte Expression des oralen ektodermalen Markers gsc mit einer verringerten Anzahl von apikalen Organneuronen und apikalem Organ. Der „stämmige“ Phänotyp zeigt bilaterale Symmetrie und alle morphologischen Merkmale einer Kontrolllarve, aber die hintere Region und das Mesoderm sind unterentwickelt. Ergänzende Abbildung 3d zeigt schematische Darstellungen von Kontroll-, komprimierten und radialen Phänotypen und ihren jeweiligen morphologischen/molekularen Orientierungspunkten.

Repräsentative Embryonen und Larven aus kolorimetrischen Analysen wurden mit einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop Leica DMRA2, ausgestattet mit einer Infinity5-Kamera (Lumenera), unter Verwendung von Hellfeld- und Differentialinterferenzkontrastoptiken abgebildet. Fluoreszierend gefärbte Proben wurden mit einem Leica SP5 LSCM gescannt. Konfokale Stapel wurden mit Fiji analysiert und Helligkeit/Kontrast und Farbbalance wurden in Pixelmator Pro (v. 2.0.3) oder Photoshop (Adobe) angepasst, wobei Änderungen immer auf das gesamte Bild und nicht auf Teile davon angewendet wurden. Die endgültigen Figuren wurden mit Illustrator (Adobe) entworfen.

Um Transkriptionsfaktormotive in Chromatin-zugänglichen Regionen rund um die cdx- und Delta-Loci zu identifizieren, verwenden wir zwei bereits verfügbare replizierte Assays für Transposase-zugängliches Chromatin unter Verwendung von Sequenzierungsbibliotheken (ATAC-seq)33, die aus >50.000 Zellen von 850–900 Coeloblastula bei 5 hpf generiert wurden. Kurz gesagt, die Zellen wurden dissoziiert und in eiskaltem ATAC-Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 % (v/v) IGEPAL, 0,1 % (v/v) Tween-20, 0,01 % (v/v) Digitonin) unter vorsichtigem Gebrauch eines Stößels zerkleinern und 3 Minuten lang auf Eis inkubieren. Nach einem schnellen Waschen mit eiskaltem PBS und weiterer Resuspension in eiskaltem ATAC-Lysepuffer wurde die Lysereaktion mit eiskaltem ATAC-Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 % (Vol.)) gestoppt /v) Tween-20) und durch dreimaliges vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens gemischt. Die Kerne wurden dann durch 10-minütige Zentrifugation bei 500 g und 4 °C in einer Festwinkelzentrifuge pelletiert und die Chromatin-Tagmentierung sowie die Bibliotheksvorbereitung wurden gemäß dem Omni-ATAC-Protokoll68 durchgeführt. Lesekartierung und Peakaufruf wurden wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt33, und die Anreicherung von Transkriptionsfaktormotiven und das Footprinting in Chromatin-zugänglichen Regionen wurde mit HOMER v.4.1169 bzw. TOBIAS v.0.12.070 durchgeführt, wobei Spuren reproduzierbarer Peaks zwischen Replikaten verwendet wurden (p < 0,05). ), erhältlich bei Gene Expression Omnibus mit der Zugangsnummer GSE184126 und einem öffentlichen Repository (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Genomspuren wurden mit pyGenomeTracks v.2.171 aufgezeichnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind. Alle in dieser Studie generierten Rohdaten der RNA-Sequenzierung sind im European Nucleotide Archive (ENA) unter der Zugangsnummer PRJEB47195 verfügbar. Darüber hinaus wurden in dieser Studie die Genomassemblierung und Annotation von Owenia fusiformis verwendet, die bei ENA unter der Zugangsnummer GCA_903813345 verfügbar ist, sowie ATAC-seq-Peaks, die bei Gene Expression Omnibus mit der Zugangsnummer GSE184126 und einem öffentlichen Repository verfügbar sind (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). ).

In dieser Studie wurde kein benutzerdefinierter Code verwendet.

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Wir danken Ferdinand Marlétaz, Daria Gavriouchkina, Bruno Vellutini und allen Mitgliedern des Martín-Durán-Labors für ihre Unterstützung und wertvollen Kommentare zum Manuskript sowie Sandra Álvarez-Carretero für ihre Hilfe bei RNA-seq-Analysen und den Mitarbeitern der Station Biologique de Roscoff für ihre Hilfe bei Sammlungen und Tierlieferungen sowie dem Oxford Genomics Centre am Wellcome Centre for Human Genetics (finanziert durch Wellcome Trust-Fördernummer 203141/Z/16/Z) für die Generierung und Erstverarbeitung von RNA-Sequenzierungsdaten. Diese Arbeit wurde durch einen European Research Council Starting Grant (Aktionsnummer 801669) an JMM-D finanziert. und ein Queen Mary, University of London-Stipendium für OS

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Océane Seudre, Allan M. Carrillo-Baltodano.

Fakultät für Bio- und Verhaltenswissenschaften. Queen Mary University of London, Mile End Road, E1 4NS, London, Großbritannien

Océane Seudre, Allan M. Carrillo-Baltodano, Yan Liang und José M. Martín-Durán

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Betriebssystem, AMC-B. und JMM-D. konzipierte und gestaltete die Studie. OS, AMC-B., YL und JMM-D. führte alle experimentellen Ansätze durch und analysierte die Daten kritisch. Betriebssystem, AMC-B. und JMM-D. hat das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und kommentiert.

Korrespondenz mit José M. Martín-Durán.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Paschalis Kratsios und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Seudre, O., Carrillo-Baltodano, AM, Liang, Y. et al. ERK1/2 ist ein uraltes Organisationssignal bei der Spiralspaltung. Nat Commun 13, 2286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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Eingegangen: 08. August 2021

Angenommen: 11. April 2022

Veröffentlicht: 28. April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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